Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões
Summary
Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.
Abstract
Os mecanismos moleculares subjacentes à fagocitose das células apoptóticas precisam ser esclarecidos com mais detalhes devido ao seu papel nas doenças imunes e inflamatórias intratáveis. Aqui desenvolvemos um método experimental para investigar a fagocitose quantitativamente usando a Drosophila da mosca da fruta, na qual a rede de genes que controla as reações de engulfment é conservada evolutivamente de mamíferos. A fim de detectar com precisão e contar fagócitos envolventes e não envolventes utilizando animais inteiros, os embriões de Drosophila foram homogeneizados para obter células dispersas, incluindo fagócitos e células apoptóticas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro em que seja possível observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros e quantificar com precisão o nível de fagocitose. Confirmamos que este método reproduz os de estudos préviosQue identificou os genes necessários para a fagocitose das células apoptóticas. Este método permite analisar a absorção de células mortas e, quando combinado com a poderosa genética da Drosophila , revelará as complexas reações fagocíticas que compõem a migração, reconhecimento, engolfamento e degradação de células apoptóticas por fagócitos.
Introduction
Em animais metazoários, por exemplo , o nematóide Caenorhabditis elegans , a mosca da fruta Drosophila melanogaster e os camundongos e os seres humanos, um grande número de células sofre apoptose durante o desenvolvimento para moldar seus corpos e na idade adulta para manter a homeostase 1 , 2 . As células apoptóticas precisam ser rapidamente removidas porque induzem inflamação nos tecidos circundantes, liberando materiais intracelulares imunogênicos, se não forem completamente removidos 3 . A fim de facilitar a remoção rápida, as células apoptóticas apresentam os chamados sinais de comer-me que são reconhecidos pelos receptores de engulfment de fagócitos e são eliminados por fagocitose 3 , 4 , 5 , 6 . Assim, a fagocitose desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do hospedeiro e, portanto, elucidando a molécula Os mecanismos subjacentes à fagocitose das células apoptóticas são importantes.
Os mecanismos responsáveis pela fagocitose das células apoptóticas parecem ser conservados evolutivamente entre as espécies nos nematóides, moscas e camundongos 7 . Vários ensaios de fagocitose estão atualmente disponíveis para avaliar a absorção de células apoptóticas nestes animais modelo. Em C. elegans , 131 células somáticas sofrem morte celular programada durante o desenvolvimento, e cadáveres celulares são fagocitadas por células vizinhas, que são fagócitos não profissionais 8 . Assim, contar o número de cadáveres de células restantes em C. elegans indica o nível de fagocitose in vivo . Ao procurar por mutantes de nematóides que mostram um número aumentado de células mortas, vários genes necessários para a fagocitose foram identificados e caracterizados geneticamente 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .
Os ensaios de fagocitose ex vivo com fagócitos de cultura primária, geralmente macrófagos, são frequentemente utilizados em camundongos. As células apoptóticas são preparadas usando linhas celulares tais como células Jurkat e são misturadas com fagócitos primários. Após uma incubação por várias horas, o número total de fagócitos e fagócitos envolventes são contados para avaliar o nível de fagocitose. Como uma modificação sofisticada deste método, o grupo de Nagata desenvolveu um teste de fagocitose ex vivo com células que expressam um ICAD resistente a caspases (inibidor da DNase ativada por caspase), em que as células apoptóticas não sofrem fragmentação do DNA apoptótico, mas o DNA ainda é escorado quando As células são fagocitadas. Quando estas células são utilizadas como alvos apoptóticos num ensaio de fagocitose, apenas o ADN de células apoptóticas engolidas é fragmentado e corado por marcação de endereçamento DUTP mediada por TdT (TUNEL). Portanto, o leveL de engolimento de células apoptóticas é medido contando sinais de TUNEL em uma mistura de fagócitos e células apoptóticas 13 .
Em D. melanogaster , fagócitos profissionais denominados hemócitos, macrófagos de Drosophila , são responsáveis pela fagocitose das células apoptóticas 14 , 15 . Além dos ensaios de fagocitose di vitro com linhas celulares de cultura, estão disponíveis ensaios de fagocitose in vivo com embriões de Drosophila inteiros. Os embriões de Drosophila são uma poderosa ferramenta para examinar o nível de absorção de células apoptóticas porque muitas células sofrem apoptose e são fagocitadas por hemócitos durante o desenvolvimento embrionário 14 , 15 , 16 . Um exemplo de um teste de fagocitose in vivo é o método desenvolvido pelo grupo de Franc. No seu método, os hemócitos são deProtegido pela imunocoloração da peroxidasina, um marcador hemicítico, as células apoptóticas são coradas usando o corante nuclear, a 7-amino-actinomicina D em embriões de Drosophila inteiros, e o número de células positivas duplas é contado como um sinal de fagocitose 17 . Outro exemplo de um teste de fagocitose em embriões baseia-se no conceito do método de Nagata descrito acima; No entanto, a fagocitose in vivo é avaliada utilizando os embriões de DNC ( Drosophila caspase-activada DNase) moscas mutantes 18 , 19 . Estes ensaios de fagocitose in vivo são úteis para observar diretamente a fagocitose in situ . Contudo, as dificuldades estão associadas à exclusão de qualquer possível viés na etapa de contagem de células fagocitantes porque é difícil observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros devido à sua espessura.
Para superar essa limitação, desenvolvemosUm novo teste de fagocitose em embriões de Drosophila . Em nosso método, para conter facilmente os hemocitros fagocitantes, os embriões integrais são homogeneizados para preparar células embrionárias dispersas. Os fagócitos são detectados pela imunocoloração de um marcador de fagócitos e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL com estas células embrionárias dispersas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro que quantificasse precisamente o nível de fagocitose. Todos os genótipos de moscas podem ser empregados neste ensaio se desenvolverem o estágio 16 de embriões 20 , o estágio de desenvolvimento no qual a depuração celular apoptótica por fagocitose é a mais abundante. Este método tem a vantagem de avaliar quantitativamente o nível de fagocitose e, portanto, pode contribuir para a identificação de novas moléculas envolvidas na fagocitose de células apoptóticas in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando embriões de Drosophila . Ao usar células embrionárias dispersas para medir a fagocitose quantitativamente, os hemócitos, os fagócitos profissionais de Drosophila , são imunossincionados para o marcador de hemicíticos Croquemort ou GFP dirigido por srpHemo , e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL neste protocolo. O nível de fagocitose é expresso como um índice fagocítico contando o número total de hemócitos e hemoc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Kaz Nagaosa e Akiko Shiratsuchi pelo seu conselho.
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
Riferimenti
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