هذا البروتوكول الدراسات كفاءة انقسام الخلايا الثديية في مصفوفات الكولاجين 3D من خلال دمج تزامن انقسام الخلية، رصد الأحداث شعبة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد باستخدام تقنية التصوير خلية يعيش، حل وقت التأمل [كنفوكل] مجهرية والتحليل الكمي للتصوير.
دراسة كيف الثدييات انقسام الخلية وينظم في 3D البيئة لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير على الرغم من أهميتها الفسيولوجية وأهمية علاجية. الأسباب المحتملة لعدم وجود الاستكشاف هي تجريبية القيود والتحديات التقنية التي تجعل دراسة انقسام الخلايا في ثقافة 3D غير فعالة. هنا، يمكننا وصف أسلوب المستندة إلى تصوير لدراسة كفاءة انقسام الخلايا الثديية وتفاعلات الخلية-مصفوفة في مصفوفات الكولاجين 3D. الخلايا المسماة الفلورسنت H2B متزامنة باستخدام مزيج العلاج حجب ونوكودازولي thymidine، متبوعاً بأسلوب يهز قبالة ميكانيكية. ثم يتم تضمين الخلايا متزامنة في مصفوفة 3D الكولاجين. ويتم رصد انقسام الخلية باستخدام الفحص المجهري خلية يعيش. تشوه ألياف الكولاجين أثناء وبعد انقسام الخلايا، ومؤشر على تفاعل الخلية-مصفوفة، يمكن رصدها وقياسها كمياً باستخدام الانعكاس [كنفوكل] كمية مجهرية. الأسلوب يقدم نهجاً تتسم بالكفاءة وعامة لدراسة الثدييات انقسام الخلية والتفاعلات الخلية-مصفوفة في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجيا. هذا النهج يوفر نظرة ثاقبة رواية الأساس الجزيئي لتنمية أنسجة طبيعية والأمراض، بل يسمح أيضا لتصميم نهج جديدة في التشخيص والعلاج.
الانقسام الخلية هو حدث حاسم في الحياة الخلوية، واللائحة التي تلعب أدواراً حاسمة في تطوير الجهاز والأنسجة. الانقسام الشاذ المتورطة في الاختلافات الوراثية الطبيعية، وعمليات الشيخوخة البشرية وتطور السرطان1،2،3،،من45. زيادة معدل انتشار الخلايا السرطانية بالمقارنة مع الخلايا الطبيعية واحدة من السمات المميزة للسرطان، على الرغم من أن سلوك الخلية غير متجانسة تماما بين أنواع مختلفة من الأورام، وحتى بين المرضى. على الرغم من النتائج السريرية الواعدة، لم تظهر بعض العقاقير أنتيميتوتيك المطورة حديثا لتكون فعالة في التجارب السريرية6،،من78،9،10 ،11. وقد أهمية النماذج التجريبية والاكلينيكية التي سينظر فيها. تقسيم أنواع عديدة من خلايا الثدييات والسرطان العادي في المصفوفات (3D) ثلاثي الأبعاد، مثل الخلايا الليفية والخلايا فيبروساركوما في الأنسجة الضامة 3D-الأغنياء من الكولاجين وخلايا السرطان المنتشر في المصفوفة خارج الخلية stromal 3D (ECM). ومع ذلك، تم إجراء الغالبية العظمى من انقسام الخلية الثديية التجارب والاختبارات على الخلايا المزروعة في ثنائي الأبعاد (2D) ركائز. أفضل يمكن أن الخص مصفوفة 3D هندستها المجهرية، والخصائص الميكانيكية والإشارات البيوكيميائية من المحتوى ثلاثي الأبعاد لكل أنسجة طبيعية ومرضية12،،من1314، 1516،،17.
دراسة كيف الثدييات انقسام الخلية وينظم في 3D بيئات لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير على الرغم من أهميتها الفسيولوجية وال18،الأهمية العلاجية19. تتضمن الأسباب المحتملة بالصعوبات التقنية والتجريبية التحديات المرتبطة بدراسة انقسام الخلية في مصفوفات ثلاثية الأبعاد. يشكل الانقسام الخلية صغيراً الزمانية في20دورة الخلية بأكملها. العمل السابقة قد أظهرت أن معدل انتشار العديد من خلايا الثدييات، مثل غدية الثدي البشري MCF-7، أوستيوساركوما البشرية U2OS والكبد البشري HepG2، أقل بكثير في مصفوفات ثلاثية الأبعاد بالمقارنة مع نظرائهم في 2D ركائز21، 22. وعلاوة على ذلك، نقل الخلايا المضمنة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد داخل وخارج التركيز أثناء تصوير خلية يعيش. وكل هذه العوامل تسهم في كفاءة منخفضة للغاية لالتقاط أحداث انقسام الخلايا في ثقافة ثلاثي الأبعاد باستخدام تقنيات التصوير.
التفاعلات بين إدارة المحتوى في المؤسسة والخلايا تلعب أدواراً حاسمة في تنظيم انقسامات الخلية. هنا، يمكننا وصف نهج لدراسة كفاءة انقسام الخلايا الثديية في مصفوفات الكولاجين 3D. يتضمن الأسلوب إدراج علامات الانقسامية للخلايا، وتزامن انقسام الخلية، فضلا عن رصد أحداث شعبة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد باستخدام تقنية التصوير خلية يعيش، حل وقت التأمل [كنفوكل] مجهرية، و التحليل الكمي للتصوير. أولاً أدخلت البروتين المسمى fluorescence هيستون H2B الخلايا كعلامة لتمييز الانقسامية والطور البيني خلايا. ثم تتم مزامنة الخلايا باستخدام مزيج العلاج حجب ونوكودازولي thymidine، متبوعاً بأسلوب يهز قبالة ميكانيكية. ثم يتم تغليف الخلايا متزامنة مباشرة إلى مصفوفات الكولاجين 3D. وترصد أحداث انقسام الخلية من خلايا متعددة كفاءة استخدام التصوير خلية يعيش الوقت الفاصل بين تضخم منخفض. ويتم رصد تشوه ألياف الكولاجين، ومؤشر على تفاعل الخلية-مصفوفة، استخدام الانعكاس [كنفوكل] مجهرية في عالية التكبير.
وقد استخدمنا هذا الأسلوب سابقا لرصد وقياس التفاعل خلية المصفوفة قبل وأثناء وبعد الانقسام اثنين من خطوط خلايا السرطان المنتشر وسرطان الأقنية الغازية البشرية MDA-ميغابايت-231 والخلايا البشرية فيبروساركوما HT1080، في الكولاجين 3D 19من المصفوفات. الأساليب المقدمة هنا توفير نهج فعالة والعامة لدراسة كل انقسام الخلية الثدييات في التفاعلات بين البيئة وخلية-مصفوفة 3D. يتم استخدام خط الخلية MDA-ميغابايت-231 كمثال في جميع أنحاء الورقة. هذا البروتوكول يوفر نظرة ثاقبة رواية الأساس الجزيئي لتنمية أنسجة طبيعية والأمراض، ويمكن أن تسمح أيضا بتصميم نهج جديدة في التشخيص والعلاج.
الدراسة السابقة لانقسام الخلية في 3D لم تكن فعالة بسبب القيود التجريبية والتحديات التقنية18،19. الخطوات الحاسمة لدراسة كفاءة الانقسام الخلوي الثدييات في مصفوفات الكولاجين 3D: (1) إدماج الأسفار المسماة علامات الانقسامية للخلايا؛ (2) تزامن انقسام الخلية؛ و (3) رصد…
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة ويمنح R01CA174388 و U54CA143868. الكتاب تود أن تقر منح بورا من جامعة جون هوبكنز للدعم لتشن وي-تونغ. ويستند إلى العمل المدعوم من “زمالة البحوث الدراسات العليا مؤسسة العلوم الوطنية” تحت رقم المنحة 1232825 هذه المواد.
Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Fugene HD | Promega | E2311 | |
Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
Collagen | Corning | 354236 | |
NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |