Pattedyr celledeling i 3D matricer via kvantitative Konfokal refleksion mikroskopi
Summary
Denne protokol effektivt undersøgelser pattedyr celledeling i 3D kollagen matricer ved at integrere synkronisering af celledeling, overvågning af division begivenheder i 3D matricer ved hjælp af live-celle imaging teknik, tidsopløst fluorescens refleksion mikroskopi og kvantitative imaging analyse.
Abstract
Undersøgelse af hvordan pattedyr celledelingen reguleres i et 3D miljø forbliver stort set uudforskede trods dens fysiologiske relevans og terapeutiske betydning. Mulige årsager til manglen efterforskning er eksperimenterende begrænsninger og tekniske udfordringer at gør studiet af celledeling i 3D kultur ineffektive. Her, beskriver vi en imaging-baseret metode til effektivt studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaktioner i 3D kollagen matricer. Celler mærket med fluorescerende H2B synkroniseres ved hjælp af en kombination af thymidine blokering og nocodazole behandling, efterfulgt af en mekanisk shake-off teknik. Synkroniseret celler er derefter indkapslet i en 3D kollagen matrix. Celledeling overvåges ved hjælp af live-celle mikroskopi. Deformation af kollagen fibre under og efter celledeling, som er en indikator for celle-matrix interaktion, kan overvåges og kvantificeres ved hjælp af kvantitative Konfokal refleksion mikroskopi. Metoden giver en effektiv og generel tilgang for at studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaktioner i en fysiologisk relevante 3D miljø. Denne tilgang ikke blot giver ny indsigt i de molekylære grundlag for udviklingen af normale væv og sygdomme, men også mulighed for udformningen af nye diagnostiske og terapeutiske strategier.
Introduction
Celle mitosen er en afgørende begivenhed i cellulære liv, regulering af som spiller afgørende roller i væv og orgel udvikling. Unormal mitosen er impliceret i naturlige genetiske variationer, menneskelige aldringsprocesser og progression af kræft1,2,3,4,5. Den forhøjede sats af udbredelsen af tumorceller sammenlignet med normale celler er et af kendetegnene ved kræft, trods at celle adfærd er ganske heterogene blandt forskellige typer af tumorer, og selv blandt patienter. På trods af lovende prækliniske resultater, har nogle nyligt udviklede antimitotic lægemidler ikke vist sig for at være effektiv i kliniske forsøg6,7,8,9,10 ,11. Relevansen af eksperimentelle og prækliniske modeller må betragtes. Mange typer af normale pattedyr og kræft celler opdele i tre-dimensionelle (3D) matricer, såsom fibroblaster og fibrosarcoma celler i kollagen-rige 3D bindevæv og metastatisk kræftceller i den 3D stromale ekstracellulære matrix (ECM). Dog, har størstedelen af pattedyr celledeling eksperimenter og assays udført på celler dyrkes på todimensionelle (2D) substrater. En manipuleret 3D matrix kunne bedre sammenfatte mikrostruktur, mekaniske egenskaber og biokemiske signaler af 3D ECM af både normale og patologiske væv12,13,14, 15,16,17.
Undersøgelse af hvordan pattedyr celledeling er reguleret i 3D miljøer forbliver stort set uudforskede trods både den fysiologiske relevans og terapeutiske betydning18,19. Mulige årsager omfatter de tekniske vanskeligheder og eksperimenterende udfordringer forbundet med at studere celledeling i 3D matricer. Celle mitosen udgør en lille tidsmæssige brøkdel i hele cellecyklus20. Tidligere arbejde har vist, at spredning satsen af mange pattedyrceller, såsom menneskelige bryst adenocarcinom MCF-7, menneskelige osteosarkom U2OS og menneskelige leveren HepG2, er meget lavere i 3D matricer sammenlignet med deres modstykker på 2D substrater21, 22. Derudover flytte celler indlejret i 3D matricer ind og ud af fokus under live-celle billeddannelse. Alle disse faktorer bidrager til den ekstremt lav effektivitet indfange celledeling begivenheder i 3D kultur ved hjælp af Billeddannende teknikker.
Interaktioner mellem ECM og celler spiller en kritisk rolle i regulering celledelinger. Her, beskriver vi en fremgangsmåde til at effektivt studere pattedyr celledeling i 3D kollagen matricer. Metoden omfatter indarbejdelse af mitotiske markører til cellerne, synkronisering af celledeling, samt overvågning af division begivenheder i 3D matricer ved hjælp af live-celle imaging teknik, tidsopløst fluorescens refleksion mikroskopi, og kvantitative imaging analyse. Fluorescens-mærket histoneprotein H2B føres først ind i cellerne som en markør for at skelne mitotiske og interphase celler. Derefter cellerne synkroniseres ved hjælp af en kombination af thymidine blokering og nocodazole behandling, efterfulgt af en mekanisk shake-off teknik. Synkroniseret celler er derefter direkte indkapslet i 3D kollagen matricer. Celledeling begivenheder af flere celler overvåges effektivt ved hjælp af lav-forstørrelse time-lapse live-celle billeddannelse. Deformationen af kollagen fibre, som er en indikator for celle-matrix interaktion, overvåges ved hjælp af mikroskopi Konfokal refleksion på høj forstørrelse.
Vi har tidligere brugt denne teknik til at overvåge og kvantificere celle-matrix interaktion før, under og efter mitosen to metastatisk kræft cellelinjer, menneskelige invasive duktalt carcinom MDA-MB-231 og menneskelige fibrosarcoma HT1080 celler, i 3D kollagen matricer19. De metoder, der præsenteres her giver en effektiv og generel tilgang for at studere begge pattedyr celledeling i et 3D miljø og celle-matrix interaktioner. MDA-MB-231 cellelinie bruges som forbillede i hele papiret. Denne protokol giver ny indsigt i de molekylære grundlag for udviklingen af normale væv og sygdomme, og kan også give mulighed for udformningen af nye diagnostiske og terapeutiske strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den forrige undersøgelse af celledeling i 3D var ikke effektivt på grund af eksperimentelle begrænsninger og tekniske udfordringer18,19. De kritiske trin for effektiv undersøgelse af pattedyr celledeling i 3D kollagen matricer er: (1) indarbejdelsen af fluorescens-mærket mitotiske markører til celler; (2) synkroniseringen af celledeling; og (3) overvågning af division begivenheder i 3D matricer ved hjælp af live-celle imaging teknik, tidsopløst fluoresce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH grants R01CA174388 og U54CA143868. Forfatterne vil gerne anerkende PURA award fra Johns Hopkins University for støtte af Wei-tong Chen. Dette materiale er baseret på arbejde støttes af de National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No. 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
Riferimenti
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O’Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).
