Division cellulaire chez les mammifères dans des Matrices 3D par microscopie Quantitative réflexion Confocal
Summary
Ce protocole a efficacement étudie la division cellulaire chez les mammifères dans les matrices de collagène 3D en intégrant la synchronisation de la division cellulaire, la surveillance des manifestations de la division dans des matrices 3D à l’aide de la technique d’imagerie de cellules vivantes, microscopie de réflexion confocal résolution temporelle et analyse d’imagerie quantitative.
Abstract
L’étude de la division cellulaire chez les mammifères comment est réglementée dans une 3D environnement demeure largement inexploré malgré sa pertinence physiologique et sa signification thérapeutique. Les raisons possibles de l’absence d’exploration sont les limitations expérimentales et les défis techniques qui rendent l’étude de la division cellulaire en culture 3D inefficace. Nous décrivons ici une méthode axée sur l’imagerie pour étudier efficacement la division cellulaire chez les mammifères et les interactions cellule-matrice dans des matrices 3D de collagène. Cellules marquées avec la H2B fluorescents sont synchronisées à l’aide de la combinaison du traitement de blocage et la nocodazole thymidine, suivie d’une technique mécanique de shake-off. Cellules synchrones sont ensuite incorporées dans une matrice de collagène 3D. La division cellulaire est contrôlée au moyen de la microscopie de cellules vivantes. La déformation des fibres de collagène pendant et après la division cellulaire, qui est un indicateur de l’interaction cellule-matrice, peut être surveillée et quantifiées à l’aide de la microscopie quantitative réflexion confocale. La méthode fournit une approche efficace et générale pour étudier la division cellulaire chez les mammifères et les interactions cellule-matrice dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Cette approche non seulement fournit de nouveaux aperçus de la base moléculaire du développement des tissus normaux et les maladies, mais permet également à la conception de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.
Introduction
Mitose de la cellule est un événement critique dans la vie cellulaire, dont la réglementation joue un rôle crucial dans le développement de tissus et organes. Une mitose anormale est impliquée dans des variations génétiques naturelles, les processus de vieillissement humain et la progression du cancer1,2,3,4,5. L’augmentation du taux de prolifération des cellules tumorales par rapport aux cellules normales est une des caractéristiques du cancer, malgré le fait que les comportements cellulaires sont assez hétérogènes entre les différents types de tumeurs et même chez les patients. En dépit des résultats précliniques prometteurs, certaines drogues antimitotiques nouvellement développé n’ont pas démontré d’être efficaces dans les essais cliniques6,7,8,9,10 ,11. La pertinence des modèles expérimentaux et précliniques doit être considérée. Plusieurs types de cellules normales de mammifères et cancer divisent dans des matrices en trois dimensions (3D), tels que les fibroblastes et cellules de Fibrosarcome en collagène riche j’ai 3D des tissus conjonctifs et cellules cancéreuses métastatiques dans la 3D stromales la matrice extracellulaire (MEC). Cependant, la grande majorité de la division cellulaire chez les mammifères des expériences et des essais ont été réalisée sur les cellules cultivées sur des substrats à deux dimensions (2D). Une matrice 3D ingénierie pourrait mieux récapituler la microstructure et propriétés mécaniques des signaux biochimiques de l’ECM 3D de deux tissus normaux et pathologiques12,13,14, 15,16,17.
L’étude des mammifère comment la division cellulaire est régulée en 3D des environnements demeure largement inexploré malgré la pertinence physiologique tant la signification thérapeutique18,19. Les raisons possibles incluent les difficultés techniques et expérimentales défis associés à étudier la division cellulaire dans des matrices 3D. La mitose cellulaire constitue une petite fraction temporelle dans le cycle cellulaire complet20. Travaux antérieurs ont montré que le taux de prolifération de plusieurs cellules de mammifères, tels que l’adénocarcinome du sein MCF-7, ostéosarcome humain U2OS et foie humain HepG2, est beaucoup plus faible dans des matrices 3D par rapport à leurs homologues sur des substrats 2D21, 22. En outre, les cellules incorporés dans des matrices 3D se déplacent dans et hors de discussion au cours de l’imagerie de cellules vivantes. Tous ces facteurs contribuent à la très faible efficacité de capture d’événements de la division cellulaire en 3D à l’aide de techniques d’imagerie de la culture.
Interactions entre les cellules et ECM jouent un rôle crucial dans la régulation des divisions cellulaires. Nous décrivons ici une approche pour étudier efficacement la division cellulaire chez les mammifères dans des matrices 3D de collagène. La méthode comprend l’incorporation des marqueurs mitotiques pour les cellules, la synchronisation de la division cellulaire, ainsi que le suivi des événements de la division dans des matrices 3D à l’aide de la technique d’imagerie de cellules vivantes, de la microscopie de réflexion confocal résolution temporelle, et analyse d’imagerie quantitative. Protéine de fluorescence-étiquetée histone H2B est tout d’abord introduit dans les cellules comme marqueurs pour différencier mitose et interphase de cellules. Puis les cellules sont synchronisées à l’aide de la combinaison du traitement de blocage et la nocodazole thymidine, suivie d’une technique mécanique de shake-off. Cellules synchrones sont alors directement encapsulées dans des matrices 3D de collagène. Événements de la division cellulaire des cellules multiples sont surveillées efficacement à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes Time-lapse faible grossissement. La déformation des fibres de collagène, qui est un indicateur de l’interaction cellule-matrice, est contrôlée au moyen de la microscopie confocale réflexion à fort grossissement.
Nous avons déjà utilisé cette technique pour surveiller et de quantifier l’interaction cellule-matrice avant, pendant et après la mitose de deux lignées de cellules de cancer métastatique, carcinome canalaire invasif humain MDA-MB-231 et les cellules humaines Fibrosarcome HT1080 en collagène 3D 19de matrices. Les méthodes présentées ici fournissent une approche efficace et générale pour étudier les deux mammifères division cellulaire dans une interaction environnement et cellule-matrice 3D. La lignée de cellules MDA-MB-231 est utilisée à titre d’exemple dans le présent document. Ce protocole prévoit de nouveaux aperçus de la base moléculaire du développement des tissus normaux et les maladies et pourrait également permettre la conception de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude précédente de la division cellulaire en 3D n’était pas efficace en raison de limitations expérimentales et défis techniques18,19. Les étapes essentielles pour une étude efficace de la division cellulaire chez les mammifères dans les matrices de collagène 3D sont : (1) l’incorporation de marqueurs mitotiques marqués par fluorescence aux cellules ; (2) la synchronisation de la division cellulaire ; et (3) le suivi des événements de la …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH accorde R01CA174388 et U54CA143868. Les auteurs aimerait remercier le prix PURA de l’Université Johns Hopkins, pour le soutien de Chen Wei-tong. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures au titre de la subvention no 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
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