בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים
Summary
פרוטוקול זה מחקרים ביעילות בתרבית של חלוקת התא במטריצות קולגן תלת-ממד על-ידי שילוב סינכרון של חלוקת התא, בפיקוח מחלקת האירועים מטריצות תלת-ממד בעזרת טכניקת דימות לחיות תאים, מיקרוסקופיה זמן לפתור השתקפות קונפוקלי וניתוח כמותי הדמיה.
Abstract
המחקר של חלוקת התא איך יונקים מוסדר ב- 3D הסביבה נשאר נחקרו במידה רבה למרות הרלוונטיות פיזיולוגיים שלה משמעות טיפולית. הסיבות האפשריות חוסר חקר הן מגבלות ניסיוני אתגרים טכניים לעיבוד המחקר של חלוקת התא בתרבות 3D לא יעיל. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת הדמיה ללמוד ביעילות בתרבית של חלוקת התא ואינטראקציות תא מטריצה ב- 3D קולגן מטריצות. תאים עם תוויות עם ויזת עבודה H2B פלורסנט מסונכרנים באמצעות השילוב של תימידין הטיפול חסימה ו nocodazole, ואחריו טכניקה לנער-off מכני. תאים מסונכרן מוטבעים ואז לתוך מטריצה תלת-ממד קולגן. חלוקת התא נעשה בעזרת מיקרוסקופ לחיות תאים. להרכב של סיבי קולגן במהלך ואחרי חלוקת התא, אשר מצביע על אינטראקציה עם תא-מטריקס, ניתן לנטר, לכמת באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותית. השיטה מספקת גישה כללית ויעילה ללמוד בתרבית של חלוקת התא ואינטראקציות מטריצה תא סביבה תלת-ממד רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. גישה זו לא רק מספק תובנות הרומן הבסיס המולקולרי של הפיתוח של הרקמות ושל מחלות, אלא מאפשר גם על עיצוב האתר של רומן גישות איבחוניות.
Introduction
מיטוזה התא הוא אירוע קריטי בחיים הסלולר, ויסות אשר ממלא תפקיד מכריע בהתפתחות רקמת ו עוגב. מיטוזה חריג הייתה שם טבעי וריאציות גנטיות, תהליכי הזדקנות האדם, ואת ההתקדמות של סרטן1,2,3,4,5. שיעור מוגבר של התפשטות של תאים סרטניים לעומת תאים נורמליים הוא אחד גולת הכותרת של סרטן, למרות העובדה כי התנהגויות תא הם די הטרוגניות בין סוגים שונים של גידולים, אפילו בקרב חולים. למרות תוצאות מבטיחות פרה, תרופות antimitotic פיתח הוכיחו לא יעילים ניסויים קליניים6,7,8,9,10 ,11. הרלוונטיות של מודלים ניסיוניים פרה חייב להילקח בחשבון. סוגים רבים של תאים נורמליים מידע יונקים וסרטן לחלק במטריצות תלת מימדי (3D), כמו fibroblasts תאים fibrosarcoma קולגן-עשיר רקמות החיבור תלת-ממד, ו תאי סרטן גרורתי תלת-ממד מטריצה חוץ-תאית סטרומה (ECM). עם זאת, הרוב המכריע של חלוקת תאים בתרבית של ניסויים, מבחני בוצעו על תאים תרבותי על מימדי מצעים (2D). מטריקס תלת-ממד מהונדסים יכול כדאי לסכם את מיקרו תכונות מכניות, אותות ביוכימיים ECM תלת-ממד של שתי רקמות רגילה, פיפטות12,13,14, 1516,,17.
המחקר של חלוקת התא איך יונקים מוסדר ב- 3D סביבות נשאר נחקרו במידה רבה למרות הרלוונטיות פיזיולוגית והן של משמעות טיפולית18,19. סיבות אפשריות כוללים את בעיות טכניות ניסיוני אתגרים הקשורים לומד חלוקת התא ב- 3D מטריצות. תא מיטוזה מהווה חלק קטן הטמפורלי מחזור התא כל20. עבודה קודמים הראו את קצב התפשטות של תאים בתרבית של רבים, כגון בשד האנושי אדנוקרצינומה MCF-7, אוסטאוסרקומה האנושי U2OS כבד אנושי HepG2, הוא נמוך בהרבה מטריצות 3D לעומת מקביליהם על מצעים 2D21, 22. יתר על כן, תאים נעוץ מטריצות 3D להיכנס ולצאת להתמקד במהלך הדמיה לחיות תאים. כל הגורמים הללו תורמים היעילות נמוכה במיוחד של לכידת אירועים תאית בתרבות תלת-ממד באמצעות טכניקות הדמיה.
אינטראקציות בין תאים ECM לשחק תפקידים חיוניים בוויסות חלוקות תאים. כאן, אנו מתארים גישה ללמוד ביעילות בתרבית של חלוקת התא ב- 3D קולגן מטריצות. השיטה כוללת שילוב של סמנים mitotic התאים, הסינכרון של חלוקת התא, כמו גם הפיקוח על חטיבת םיעוריא מטריצות תלת-ממד באמצעות טכניקת דימות לחיות תאים, זמן לפתור השתקפות קונאפוקלית מיקרוסקופ, ו ניתוח ההדמיה כמותית. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית היסטון חלבון ויזת עבודה H2B הוא הציג לראשונה לתוך התאים כסמן כדי להבדיל mitotic לאטמוספרה תאים. אז התאים מסונכרנים באמצעות השילוב של תימידין הטיפול חסימה ו nocodazole, ואחריו טכניקה לנער-off מכני. תאים מסונכרן מכן אנקפסולציה ישירות לתוך קולגן 3D מטריצות. חלוקת התא אירועים של תאים מרובים מנוטרים ביעילות באמצעות הדמיה לחיות תאים זמן לשגות ההגדלה נמוך. להרכב של סיבי קולגן, אשר מצביע על אינטראקציה עם תא-מטריקס, נעשה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות בהגדלה-גבוהה.
השתמשנו בעבר בטכניקה זו כדי לפקח ולכמת תא-מטריצת אינטראקציה לפני, במהלך ואחרי של מיטוזה של שתי שורות תאים סרטן גרורתי, האנושי קרצינומה ductal פולשנית מד א-MB-231 תאים אנושיים fibrosarcoma HT1080, קולגן תלת-ממד מטריצות19. השיטות המובאות כאן מספקים גישה כללית ויעילה ללמוד שני חלוקת תאים בתרבית של אינטראקציות תא מטריצה וסביבה תלת-ממד. שורת התאים של מד א-MB-231 משמש כדוגמה לאורך הנייר. פרוטוקול זה מספק תובנות הרומן הבסיס המולקולרי של הפיתוח של הרקמות ושל מחלות, העלולה לאפשר גם על עיצוב האתר של רומן גישות איבחוניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הקודם של חלוקת התא ב- 3D לא היה יעיל עקב מגבלות ניסיוני, האתגרים הטכניים18,19. השלבים הקריטיים ללימוד יעיל של חלוקת תאים בתרבית של-3D קולגן מטריצות הם: (1) שילוב של התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית סמני mitotic על התאים; (2) הסינכרון של חלוקת התא; (3) הפיקוח על חטיבת…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מעניקה R01CA174388 ו- U54CA143868. המחברים רוצה להכיר את הפרס PURA מ אוניברסיטת ג’ונס הופקינס לתמיכה של חן ווי-טונג. חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת על-ידי הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה תחת גרנט מס 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
Riferimenti
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O’Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).
