양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열
Summary
이 프로토콜은 효율적으로 세포 분열의 동기화를 통합 하 여 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 연구 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 그리고 양적 이미징 분석입니다.
Abstract
어떻게 포유류의 세포 연구 규제는 3d 환경 크게 그것의 생리 적인 관련성 및 치료의 중요성에도 불구 하 고 미개척 남아. 탐험의 부족에 대 한 가능한 이유는 실험 제한 및 비효율적인 3D 문화에서의 세포 연구를 렌더링 하는 기술적 과제 이다. 여기는 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 상호 작용 3D 콜라겐 매트릭스에 효율적으로 공부 하는 영상 기반 방법에 설명 합니다. 형광 H2B 표시 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 셀 다음 3D 콜라겐 매트릭스에 포함 됩니다. 세포 분열은 라이브 셀 현미경을 사용 하 여 모니터링 됩니다. 변형 콜라겐 섬유의 세포 분열, 세포-매트릭스 상호 작용은, 전후 동안 모니터링할 수 있습니다 그리고 양적 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 계량. 포유류 세포 분열 및 세포-매트릭스 순수 관련 3D 환경에서 상호 작용을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 방법은 정상 조직과 질병 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 뿐만 아니라 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.
Introduction
세포 유사 분열의 규제 조직 및 장기 개발에 중요 한 역할 세포 인생에서 중요 한 이벤트입니다. 비정상적인 유사 분열은 자연 유전 변이, 인간의 노화 과정과 암1,2,3,,45의 진행에 연루 됩니다. 정상 세포와 비교 하는 종양 세포의 증식의 증가 속도 사실 셀 동작 종양의 종류 및 환자 중 에서도 상당히 이질적인에 불구 하 고 암의 특징 중 하나입니다. 유망한 임상 결과도 불구 하 고 일부 새로 개발 된 antimitotic 약물 임상 시험6,7,,89,10 에에서 효과가 표시 되지 않은 11. 실험 및 전 임상 모델의 관련성 고려 될 수 있다. 많은 유형의 정상 포유류 및 암 세포 섬유 아 세포와 콜라겐-풍부한 3D 결합 조직, fibrosarcoma 셀과 전이성 암 세포는 3D stromal 세포 외 기질 (ECM)에 같은 3 차원 (3D) 행렬에 나눕니다. 그러나, 포유류 세포 분열 실험 및 분석의 대다수가 2 차원 (2D) 기판에 경작 하는 세포에 수행 되었습니다. 미세, 기계적 특성, 및 두 정상과 pathologic 조직12,,1314, 의 3D ECM의 생 화 확 적인 신호 설계 3D 매트릭스 정리 더 수 15,,1617.
어떻게 포유류의 세포 연구 규제 차원에서 환경 생리 관련성 및 치료 중요성18,19도 불구 하 고 크게 미개척 남아. 가능한 이유는 기술적인 어려움 및 3D 매트릭스에서 세포 분열을 공부와 관련 된 실험 과제 포함 됩니다. 세포의 유사 분열 전체 세포 주기20에 극히 일시적인 구성합니다. 이전 작업을 인간 유 방 선 암 MCF-7, 인간의 다리 U2OS, 그리고 인간의 간 같은 많은 포유류 세포의 확산 속도 보이고 있다 HepG2에 훨씬 낮은 3D 매트릭스 2D 기판21에 그들의 대조 물과 비교 22. 또한, 세포 3D 매트릭스에 포함 된 라이브 셀 이미징 동안 초점 밖으로 이동 합니다. 이러한 모든 요소는 이미징 기술을 사용 하 여 3D 문화에서 세포 분열 이벤트 캡처의 매우 낮은 효율에 기여.
세포와 ECM 사이 상호 작용 세포 분열 조절에 중요 한 역할을 재생 합니다. 여기, 우리는 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열을 효율적으로 공부 하는 방법을 설명 합니다. 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니터링 뿐만 아니라 세포, 세포 분열의 동기화 mitotic 마커의 포함 하는 메서드 및 양적 이미징 분석입니다. 형광 표시 된 히스톤 단백질 H2B mitotic 차별화 및 interphase 셀 표식으로 셀에 처음 소개 된다. 다음 셀 티 미 딘 및 nocodazole 처리, 기계적인 동요-오프 기술에 의해 다음의 조합을 사용 하 여 동기화 됩니다. 동기화 된 세포는 직접 3D 콜라겐 매트릭스에 캡슐화 됩니다. 여러 셀의 세포 분열 이벤트 낮은 확대 경과 라이브 셀 이미징에 효율적으로 사용 하 여 모니터링 됩니다. 세포-매트릭스 상호 작용은, 콜라겐 섬유의 변형 고배율에서 반사 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 모니터링 됩니다.
우리가 감시 하 고 세포-매트릭스 상호 작용 하는 동안과 이후, 이전 두 개의 전이성 암 세포 선, 인간의 침략 적인 ductal 암 MDA-MB-231 및 3D 콜라겐에서 인간의 fibrosarcoma HT1080 세포의 유사 분열을 계량이 기술을 사용한 이전 행렬19. 여기에 제시 된 방법 3D 환경과 세포-매트릭스 상호 작용에서 모두 포유류 세포 분열을 공부 하는 효율적이 고 일반적인 접근을 제공 합니다. MDA-MB-231 셀 라인 종이 걸쳐 예제로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 정상 조직과 질병, 개발의 분자 기초에 새로운 통찰력을 제공 하 고 또한 새로운 진단 및 치료 접근의 디자인에 대 한 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3d에서 세포 분열의 이전 연구 실험 제한 및 기술 과제18,19효율적인 아니었다. 3D 콜라겐 매트릭스에 포유류 세포 분열의 효율적인 연구를 위한 중요 한 단계는: (1) 셀;에 mitotic 마커 형광 표시 관 (2) 세포 분열;의 동기화 (3) 부문 이벤트 라이브 셀 이미징 기법, 시간 해결 confocal 반사 현미경 검사 법, 양적 이미지 분석을 사용 하 여 3D 매트릭스에서의 모니?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01CA174388 및 U54CA143868를 부여. 저자는 PURA 수상 웨이 통 첸의 지원에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 인정 하 고 싶습니다. 이 자료는 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 보조금 번호 1232825 아래에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
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