Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa
Summary
Este protocolo eficientemente estuda divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D, integrando a sincronização da divisão celular, monitoramento de eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem live-célula, microscopia de reflexão confocal tempo-resolvido e análise quantitativa de imagem.
Abstract
O estudo de mamífero como a divisão celular é regulamentado em um 3D ambiente permanece largamente inexplorado, apesar de sua relevância fisiológica e significado terapêutico. Possíveis razões para a falta de exploração são as limitações experimentais e desafios técnicos que tornam o estudo da divisão celular em 3D cultura ineficiente. Aqui, descrevemos um método baseado em imagem para estudar eficientemente a divisão de células de mamíferos e célula-matriz interações em matrizes de colágeno 3D. Células rotuladas com H2B fluorescentes são sincronizadas usando a combinação de tratamento de bloqueio e nocodazole timidina, seguido por uma técnica mecânica de agitar-se. Células sincronizadas depois são incorporadas a uma matriz de colagénio 3D. Divisão celular é monitorada usando microscopia de viver-pilha. A deformação das fibras de colágeno durante e após a divisão celular, que é um indicador de interação célula-matriz, pode ser monitorizada e quantificados usando microscopia de reflexão confocal quantitativa. O método fornece uma abordagem eficiente e geral para estudar a divisão de células de mamíferos e célula-matriz interações em um ambiente 3D fisiologicamente relevante. Esta abordagem não só fornece novos insights sobre a base molecular do desenvolvimento do tecido normal e doenças, mas também permite o desenho de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas.
Introduction
Mitose da célula é um evento crítico na vida celular, o Regulamento das quais tem um papel crucial no desenvolvimento de tecidos e órgãos. Mitose anormal está implicada na variação genética natural, os processos de envelhecimento humano e a progressão do câncer1,2,3,4,5. O aumento da taxa de proliferação de células tumorais em comparação com células normais é uma das marcas registradas do cancro, apesar do fato de que comportamentos de célula são bastante heterogêneos entre os diferentes tipos de tumores e até mesmo entre os pacientes. Apesar de resultados promissores pré-clínicos, alguns medicamentos antimitóticos recém-desenvolvidos não têm demonstrado para ser eficaz em testes clínicos6,7,8,9,10 ,11. A relevância de modelos experimentais e pré-clínicos tem que ser considerado. Muitos tipos de células de mamíferos e câncer normais dividem-se em matrizes de tridimensionais (3D), como fibroblastos e células de Fibrossarcoma em colágeno-rico 3D tecidos conjuntivos e células de câncer metastático na matriz extracelular do estroma 3D (ECM). No entanto, a grande maioria dos experimentos de divisão de células de mamíferos e os ensaios foram realizada em células cultivadas em substratos de bidimensional (2D). Uma matriz 3D projetado melhor pode recapitular a microestrutura, propriedades mecânicas e bioquímicos sinais de ECM 3D de ambos os tecidos normais e patológicos12,13,14, 15,16,17.
O estudo de mamífero como a divisão celular é regulado em 3D ambientes permanece largamente inexplorado, apesar de tanto a relevância fisiológica e o significado terapêutico18,19. Possíveis razões incluem a dificuldades técnicas e desafios experimentais associados a estudar a divisão celular em matrizes 3D. Mitose celular constitui uma pequena fração temporal no ciclo celular completo20. Trabalho anterior demonstrou que a taxa de proliferação de muitas células de mamíferos, como o adenocarcinoma de mama humano MCF-7, osteossarcoma humana U2OS e fígado humano HepG2, é muito menor em matrizes 3D em comparação com suas contrapartes em substratos 2D21, 22. Além disso, células incorporado em matrizes 3D entram e saem de foco durante a imagem latente da viver-pilha. Todos esses fatores contribuem para a extremamente baixa eficiência de captura de eventos de divisão celular em 3D cultura usando técnicas de imagem.
Interações entre o ECM e células desempenham um papel crítico na regulação de divisões celulares. Aqui, descrevemos uma abordagem para estudar a divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D eficientemente. O método inclui a incorporação de marcadores mitóticas para as células, sincronização da divisão celular, bem como o acompanhamento dos eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem live-célula, microscopia de reflexão confocal tempo-resolvido, e análise quantitativa de imagem. Proteína de fluorescência-etiquetada histona H2B é introduzido pela primeira vez dentro das células, como um marcador para diferenciar mitose e interfase as células. Em seguida, as células são sincronizadas usando a combinação de tratamento de bloqueio e nocodazole timidina, seguido por uma técnica mecânica de agitar-se. Células sincronizadas então são encapsuladas diretamente em matrizes de colágeno 3D. Eventos de divisão celular de células múltiplas são monitorados com eficiência usando imagens de viver-pilha baixa-ampliação lapso de tempo. A deformação das fibras de colágeno, que é um indicador de interação célula-matriz, é monitorada usando microscopia confocal reflexão em alta ampliação.
Anteriormente usamos essa técnica para monitorar e quantificar a interação célula-matriz antes, durante e após a mitose de duas linhas de células de câncer metastático, carcinoma ductal invasivo humano MDA-MB-231 e Fibrossarcoma humana HT1080 células, colágeno 3D matrizes de19. Os métodos aqui apresentados fornecem uma abordagem eficiente e geral para estudar os dois mamíferos divisão celular em um 3D interações de ambiente e célula-matriz. A linha de celular MDA-MB-231 é usada como um exemplo em todo o papel. Este protocolo fornece novos insights sobre a base molecular do desenvolvimento do tecido normal e doenças e também pode permitir para a concepção de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estudo prévio de divisão celular em 3D não era eficiente devido às limitações experimentais e desafios técnicos18,19. Os passos críticos para o estudo eficiente de divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D são: (1) a incorporação de fluorescência-etiquetada marcadores mitóticas para as células; (2) a sincronização da divisão celular; e (3) o acompanhamento dos eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01CA174388 e U54CA143868. Os autores gostaria de reconhecer o prêmio PURA da Universidade Johns Hopkins para suporte de Chen Wei-tong. Este material é baseado em trabalho suportado pela nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa sob Grant no. 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
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