Divisione delle cellule dei mammiferi in matrici 3D tramite microscopia confocale quantitativa di riflessione

Lijuan He; Alexandra Sneider; Weitong Chen; Michelle Karl; Vishnu Prasath; Pei-Hsun Wu; Gunnar Mattson; Denis Wirtz

doi:10.3791/56364

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Divisione delle cellule dei mammiferi in matrici 3D tramite microscopia confocale quantitativa di riflessione

8.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/56364

⸱

29 novembre 2017

Lijuan He^*¹^,² , Alexandra Sneider^*¹ , Weitong Chen¹ , Michelle Karl¹ , Vishnu Prasath³ , Pei-Hsun Wu¹^,² , Gunnar Mattson³ , Denis Wirtz¹^,²^,⁴

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University, ²Johns Hopkins Physical Sciences - Oncology Center, Johns Hopkins University, ³Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, ⁴Departments of Oncology and Pathology and Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo studia in modo efficiente divisione cellulare dei mammiferi in matrici di collagene 3D integrando sincronizzazione della divisione cellulare, monitoraggio degli eventi di divisione in matrici 3D utilizzando la tecnica di imaging cellule vive, microscopia risolta in tempo di riflessione confocale e quantitative analisi di imaging.

Abstract

Lo studio di mammifero come la divisione cellulare è regolato in un 3D ambiente rimane in gran parte inesplorata, nonostante la sua rilevanza fisiologica e significato terapeutico. Motivi possibili per la mancanza di esplorazione sono i limiti sperimentali e le sfide tecniche che rendono lo studio di divisione delle cellule in cultura 3D inefficiente. Qui, descriviamo un metodo basato su formazione immagine per studiare in modo efficiente divisione cellulare dei mammiferi e delle interazioni cellula-matrice in matrici di collagene 3D. Cellule identificate con H2B fluorescenti vengono sincronizzate utilizzando la combinazione di trattamento blocco e nocodazole della timidina, seguita da una tecnica di shake-off meccanica. Sincronizzate le cellule vengono quindi incorporate in una matrice di collagene 3D. Divisione cellulare viene monitorata tramite microscopia di cellule vive. La deformazione delle fibre del collagene durante e dopo la divisione cellulare, che è un indicatore di interazione cellula-matrice, possa essere monitorata e quantificati tramite microscopia confocale quantitativa di riflessione. Il metodo fornisce un approccio efficiente e generale per studiare la divisione delle cellule dei mammiferi e delle interazioni cellula-matrice in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante. Questo approccio non solo fornisce le comprensioni novelle nella base molecolare dello sviluppo del tessuto normale e malattie, ma permette anche per la progettazione di nuovi approcci diagnostici e terapeutici.

Introduzione

Mitosi delle cellule sono un evento critico nella vita cellulare, il regolamento di cui svolge un ruolo cruciale nello sviluppo di tessuti ed organi. Mitosi anomale sono implicato in variazioni genetiche naturali, processi di invecchiamento umano e la progressione del cancro¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Dell'aumento del tasso di proliferazione delle cellule tumorali rispetto alle cellule normali è uno dei tratti distintivi del cancro, nonostante il fatto che i comportamenti delle cellule sono piuttosto eterogenei tra diversi ....