Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler
Summary
Bu iletişim kuralı verimli çalışmalar 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi hücre bölünmesi, eşitlenmesi entegre ederek 3B matrisleri canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu kullanarak bölümü olayların izlenmesi ve nicel analiz görüntüleme.
Abstract
Nasıl memeli hücre bölünmesi çalışmanın düzenlenmiş bir 3D çevre onun fizyolojik alaka ve tedavi edici öneme rağmen büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Keşif eksikliği için olası nedenler deneysel sınırlamalar ve hücre bölünmesi çalışma 3D kültüründe verimsiz hale teknik zorluklar nelerdir. Burada, verimli bir şekilde çalışma memeli hücre bölünmesi ve 3D kollajen matrisler etkileşimlerde hücre-matris bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklanmaktadır. Floresan H2B ile etiketli hücreleri timidin engelleme ve nocodazole tedavi, bir mekanik sallamak-off tekniği ile takip birleşimini kullanarak eşitlenir. Eşitlenmiş hücreleri sonra 3D kollajen matris gömülür. Hücre bölünmesi yaşamak-cep mikroskobu kullanılarak izlenir. Deformasyon sırasında ve sonra hücre bölünmesi, hücre-matris etkileşim bir göstergesidir, kollajen liflerinin izlenebilir ve nicel confocal yansıma mikroskobu kullanılarak sayılabilir. Memeli hücre bölünmesi ve hücre-matris etkileşimleri fizyolojik ilgili 3D ortamında çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım yöntemdir. Bu yaklaşım sadece gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli roman ilgili bilgiler sağlar, ama aynı zamanda yeni tanı ve tedavi yaklaşımları tasarımı için sağlar.
Introduction
Hücre mitoz hangi tür ile doku ve organ gelişiminde çok önemli rol oynar hücresel hayatında önemli bir olay var. Anormal mitoz doğal genetik varyasyonları, insan yaşlanma süreçlerini ve kanser1,2,3,4,5ilerlemesini karıştığı. Normal hücreleri ile karşılaştırıldığında tümör hücrelerinin çoğalması artış oranı kanser hücre davranışları oldukça heterojen değişik tümörler arasında ve hastalar arasında bile aslında rağmen işaretlerinden biridir. Preklinik umut verici sonuçlar rağmen klinik6,7,8,9,10 ‘ etkili olabilmesi için bazı yeni geliştirilen antimitotic ilaçlar gösterememiştir ,11. Deneysel ve Preklinik modellerin ilgisi dikkate alınması gereken vardır. Üç boyutlu (3D) matrisler, fibroblastlar ve kollajen bakımından zengin 3D bağ doku hücrelerinde Fibrosarkom ve 3D stromal hücre dışı Matriks (ECM) metastatik kanser hücreleri gibi içinde adl tip-in normal memeli ve kanser hücreleri bölün. Ancak, memeli hücre bölünmesi deneyleri ve deneyleri büyük çoğunluğu iki boyutlu (2D) yüzeyler üzerinde kültürlü hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiş. Bir mühendislik 3D matris daha iyi Mikroyapı, mekanik özellikleri ve her iki normal ve patolojik doku12,13,14, 3D ECM biyokimyasal sinyalleri özetlemek 15,16,17.
Nasıl memeli hücre bölünmesi çalışmanın düzenlenmiştir 3D ortamlar fizyolojik alaka ve terapötik önemi18,19rağmen büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Teknik sorunlar ve deneysel zorluklar 3D matris hücre bölünmesi eğitimi ile ilişkili olası nedenler. Hücre mitoz bütün hücre döngüsü20küçük bir zamansal bölümü kabul ettiğiniz anlamına gelir. Önceki çalışma olduğunu göstermiştir bu insan meme adenokarsinom MCF-7, insan osteosarkom U2OS ve insan karaciğer gibi birçok memeli hücrelerinin proliferasyonu oranı HepG2, çok daha düşük 2D yüzeylerde21, onların meslektaşları ile karşılaştırıldığında 3D matris içinde 22. Ayrıca, 3D matris içinde gömülü hücreler odak içinde ve dışında canlı hücre görüntüleme sırasında geçiş yapar. Tüm bu faktörlerin hücre bölünmesi olayları görüntüleme teknikleri kullanarak 3D kültüründe yakalama son derece düşük verimlilik katkıda bulunur.
ECM ve hücreler arasındaki etkileşimler hücre bölünmeler düzenlenmesinde önemli rol oynarlar. Burada, verimli bir şekilde 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi çalışmaya bir yaklaşımı açıklamak. Hücreleri, hücre bölünmesi eşitlenmesi yanı sıra 3B matrisleri kullanarak canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu, bölünme olayları izleme Mitotik işaretleri birleşme yöntemi içerir ve nicel analiz görüntüleme. Floresans etiketli Histon protein H2B ilk hücrelere Mitotik ayırt etmek ve hücreleri Interphase bir işareti olarak tanıtıldı. Sonra hücreleri timidin engelleme ve nocodazole tedavi, bir mekanik sallamak-off tekniği ile takip birleşimini kullanarak eşitlenir. Eşitlenmiş hücreleri sonra doğrudan 3D kollajen matrisler kapsüllü. Birden çok hücre hücre bölünmesi olaylar verimli bir şekilde düşük-büyütme hızlandırılmış canlı hücre Imaging’i kullanma izlenir. Hangi hücre-matris etkileşim bir göstergesidir, deformasyon kollajen liflerinin confocal yansıma mikroskobu yüksek-büyütme oranında kullanarak izlenir.
Biz daha önce önce sırasında ve sonrasında iki metastatik kanser hücre hatları, insan invaziv duktal Karsinom MDA-MB-231 ve 3D kollajen insan Fibrosarkom HT1080 hücrelerinde mitoz hücre-matris etkileşim ölçmek ve izlemek için bu teknik kullandık matrisler19. Burada sunulan yöntemleri her iki memeli hücre bölünmesi 3D çevre ve hücre-matris etkileşimleri çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım sağlar. MDA-MB-231 hücre satırı kağıt boyunca bir örnek olarak kullanılır. Bu iletişim kuralı gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli yeni anlayışlar sağlar ve ayrıca yeni tanı ve tedavi yaklaşımları tasarımı için izin verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre bölünmesi 3D önceki çalışmada deneysel sınırlamalar ve teknik sorunlar18,19nedeniyle verimli değildi. Memeli hücre bölünmesi 3D kollajen matrisler içinde verimli çalışması için kritik adımlar şunlardır: (1) birleşme Floresans etiketli Mitotik işaretleri hücrelere; (2 eşitlenmesi hücre bölünmesi; ve (3) 3D matrisler canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu ve nicel görüntüleme an…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH tarafından desteklenen R01CA174388 ve U54CA143868 verir. Yazarlar Wei-tong Chen desteği için Johns Hopkins Üniversitesi’nden PURA ödülü kabul etmek istiyorum. Bu malzeme Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu Grant No 1232825 altında tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
Riferimenti
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O’Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).
