JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

في الوقت الحقيقي مهتز الناجمة عن تحويل الفحص للكشف عن البريونات CWD في المواد البرازية

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف تقنية تضخيم بريون بسيطة وسريعة وفعالة، طريقة التحويل في الوقت الحقيقي التي يسببها مهتز (RT-كويك).

Abstract

أسلوب RT كويك حساسة في المختبر بريون الخلية الحرة تضخيم مقايسة تستند أساسا إلى المصنف ميسفولدينج وتجميع المؤتلف بريون البروتين (PrP) الركيزة باستخدام بذور بريون كقالب للتحويل. RT كويك هو أسلوب رواية الفائق الذي يماثل في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (PCR). ويستند الكشف عن نمو فيبريل اميلويد صبغ ثيوفلافين T، الذي فلوريسسيس عند محددة من التفاعل مع البروتينات الغنية ᵦ–ورقة. وهكذا، يمكن الكشف عن تشكيل اميلويد في الوقت الحقيقي. لقد حاولنا في تطوير اختبار فرز غير الغازية يمكن الاعتماد عليها لاكتشاف البريونات (CWD) مرض الهزال المزمن في استخراج البراز. هنا، نحن تكيفت على وجه التحديد تقنية RT كويك تكشف PrPSc البذر النشاط في براز CWD المصابة سيرفيدس. في البداية، كان نشاط بذر مقتطفات البراز ونحن على استعداد منخفضة نسبيا في الرايت-كويك، ربما بسبب مثبطات الإنزيم المحتملة في المواد البرازية. لتحسين النشاط بذر مقتطفات البراز وإزالة مثبطات الإنزيم المحتملة، ونحن تجانس عينات البراز في المخزن مؤقت الذي يحتوي على المنظفات ومثبطات البروتياز. كما قدمنا العينات لمنهجيات مختلفة تركز PrPاتفاقية استكهولم على أساس ترسيب البروتين باستخدام حمض فوسفوتونجستيك الصوديوم، وقوة الطرد المركزي. أخيرا، تم اختبار مقتطفات البراز بالامثل RT-كويك التي شملت استبدال الركيزة في البروتوكول تحسين حساسية الكشف. وهكذا أنشأنا بروتوكولا للكشف عن حساسية بريون CWD البذر النشاط في براز سيرفيدس ما قبل السريرية والسريرية التي RT-كويك، التي يمكن أن تكون أداة عملية لتشخيص CWD غير الغازية.

Introduction

أمراض بريون أو الاعتلال الاسفنجي (تسي) اضطرابات الأعصاب بما في ذلك كروتزفيلد-جاكوب (جاكوب) في البشر، والتهاب الدماغ الاسفنجي البقري (مرض جنون البقر) في الماشية، الرعاش في الأغنام والماعز، والهزال المزمن المرض (CWD) في سيرفيدس 1،2. الاسفنجي تتميز بالمظهر الاسفنجي مميزة وفقدان الخلايا العصبية في الدماغ. طبقاً لفرضية “البروتين فقط”، البريونات هي تتألف أساسا من الحزب الثوريSc (‘المحكمة العليا’ الرعاش) 3، isoform تجمعات من البروتين ترميز المضيف بريون الخلوية، الحزب الثوريج. PrPSc ناتجة عن تحويل PrPج إلى المطابقة التخصيب في5، 4،ᵦ-أوراق6 التي يمكن أن تعمل كبذرة لربط وتحويل الجزيئات PrPج الأخرى. جزيئات PrPاتفاقية استكهولم الذي تم إنشاؤه حديثا أدرجت في 7،بوليمر تنامي8 الذي اخترق ليغومرات الأصغر، أسفرت عن أكبر عدد من الأنوية المعدية. PrPاتفاقية استكهولم هو عرضه للتجميع ومقاومة جزئيا إلى 9،البروتياز10.

CWD يؤثر الأيائل البرية والمستزرعة (سيرفوس canadensis)، والوعول (هيميونوس أودوكويليوس)، والأبيض – الذيل الغزلان (يوم الذكرى العالمي؛ فيرجينيانوس أودوكويليوس)، موس (السيس السيس)، والرنة (رانجيفير تاراندوس تاراندوس) 11،،من1213. ويعتبر هذا المرض بريون المعدي أكثر مع انتقال أفقي يفضلها سيرفيد التفاعلات والثبات البيئي للعدوى 14،15. خلافا لسائر الأمراض بريون حوصر فيها تراكم PrPاتفاقية استكهولم والعدوى إلى المخ، في CWD هذه توجد أيضا في الأنسجة المحيطية وسوائل الجسم مثل اللعاب والبول والبراز 16،17، 18.

إيمونوهيستوتشيميستري يعتبر معيار الذهب لتشخيص CWD الكشف عن توزيع PrPاتفاقية استكهولم والإسفنجي آفات 19،20. أليسا وفي حالات نادرة، كما تستخدم لطخة غربية لتشخيص CWD. وهكذا، تشخيص المرض بريون الحالي يعتمد أساسا على اكتشاف البريونات في الأنسجة بعد الوفاة. يتوفر التشخيص الوفاة ل CWD بأخذ اللوزتين أو خزعات يمنى الشرج الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (رامالت)؛ ومع ذلك، هذا الإجراء الغازية ويتطلب القبض على الحيوانات. وهكذا، سيكون استخدام العينات الوصول إليها بسهولة، مثل البول والبراز، طريقة عملية لكشف بريون CWD. بيد تلك الفضلات هاربور المنخفضة نسبيا لتركيزات البريونات الكشف عن الحد الأدنى لطرق التشخيص الحالية. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى أداة تشخيصية أكثر حساسية وعالية إنتاجية. في المختبر نظم التحويل، مثل البروتين misfolding التضخيم دوري الاعتداء (بمكا) 21، اميلويد بذر المقايسة، والتحويل في الوقت الحقيقي التي يسببها مهتز (RT-كويك) مقايسة 22،23، 24 أدوات قوية جداً استغلال قدرة ذاتية نشر PrPاتفاقية استكهولم على تقليد في المختبر بريون عملية التحويل وتضخيم وبالتالي وجود كميات دقيقة من الحزب الثوري الشعبياتفاقية استكهولم إلى مستويات لا يمكن اكتشافها 25 ،26. ومع ذلك، يأخذ الأسلوب RT كويك، استفادة حقيقة أن المنتج تحويل أثري في هيكل الثانوية β-ورقة تحديداً ربط ثيوفلافين تي (ال تي). ولذلك، ينمو PrP المؤتلف (ربرب) عند تحويل المصنف إلى ييفات اميلويد الذي ربط ال تي، وهكذا يمكن الكشف عن في الوقت الحقيقي عن طريق قياس الأسفار من ال تي معبراً عنها بوحدات fluorescence النسبي (رفو) مع مرور الوقت. مجرد رصد، يمكن استخدامها في رفو لتقييم أنشطة بذر النسبي، والمعايير الكمية مثل مرحلة انتقالية. يمثل مرحلة انتقالية الوقت (ح) المطلوب للوصول إلى العتبة، خلال الذي ربرب التحويل في المرحلة المبكرة من رد فعل أقل من الحد الكشف من الأسفار ال تي. عند نهاية المرحلة الفاصلة الواضحة، الملازمة لتشكيل نواة اميلويد كافية (نويات/استطالة)، الأسفار ال تي يتجاوز مستوى الحد الأدنى ويصبح إيجابيا. نمو اميلويد ويمكن الكشف عن ييفات في الوقت الحقيقي، و الحزب الثوري الأولىاتفاقية استكهولم أو بذر النشاط الواردة في العينة يتم تضخيمه بتجزئة الذي يولد المزيد من البذور. هذه البذور يدفع بدوره إلى مرحلة أسي سريع لنمو الألياف اميلويد.

لأن هذا التحليل قادرة على كشف منخفضة 1 fg PrPاتفاقية استكهولم 24، حساسية عالية يؤهل هذا الأسلوب لتحقيق الوفاة أنتي أو التشخيص غير الغازية عن طريق الكشف عناتفاقية استكهولم من الحزب الثوري الشعبي في مختلف الأنسجة الطرفية، والإفرازات أو غيرها أنواع العينة إيواء مستويات منخفضة من العدوى. RT كويك يوفر بالتأكيد مزايا أكثر من غيرها فحوصات لإمكانية تكرار نتائج والتطبيق العملي، والسرعة (أقل من 50 ح) وتكاليف منخفضة مقارنة بالمقايسة. وهو يتجنب التعقيدات التقنية مثل سونيكيشن المستخدمة في بمكا؛ أيضا، فإنه يتم في ميكروسكوبية مختومة الشريط الذي يقلل من خطر تلوث الهباء الجوي لكل بئر. ويمكن تنسيق متعدد جيدا تحليل عينات تصل إلى 96 في نفس التجربة. لمواجهة هذه المشكلة المتكررة من إيجابيات كاذبة والتحويل التلقائي من ربرب في فحوصات التحويل في المختبر تنفيذ عتبة (الوقف) في الرايت كويك مفيد جداً. في الواقع، استناداً إلى نتائج المراقبة السلبية (رفو متوسط العينات السلبية + 5 SD 27)، أساس هو إعداد من الذي يمكن أن يتم التمييز بين نماذج إيجابية وسلبية. وهكذا يمكن أن تساعد استخدام replicates أربعة لكل عينة لتحديد عينة إيجابية عند 50 في المائة على الأقل من replicates إظهار إشارة إيجابية، أي عبور وقف إنتاج المواد الانشطارية 28. ليس مطلوباً التماثل بين البذور والركيزة في الرايت-كويك، كما مثلاً في دراسة سابقة، ربرب الهامستر تم العثور على أن تكون أكثر حساسية ركيزة الركيزة مثلى في البشر PrPجنون بالمقارنة مع المصنف والمصنف الرعاش الأغنام ردود فعل 29. ربرب تشيميريك الهامستر-الأغنام كما اقترح أن تكون ركيزة أكثر مناسبة من ربرب البشرية لاكتشاف البريونات جاكوب المتغير البشري 30. وهكذا، استخدام ركائز ربرب من مختلف الأنواع شائعة جداً في هذا التحليل. هذا التحليل قد طبقت بنجاح على عدة أمراض بريون، مثل متفرقة جاكوب 31،،من3233، الجنرالأمراض بريون آتيك 34ومرض جنون البقر 35،،من3637والرعاش 23،36و CWD 38،39،،من4041، 42. الدراسات باستخدام معالجة النخاعي وكل الدم واللعاب والبول كما البذور في الرايت كويك كانت كلها ناجحة للكشف عن الحزب الثوريSc 38،39،،من4041، 42-لتعزيز قدرة الكشف في عينات مثل بلازما الدم التي قد تحتوي على مثبطات لتشكيل اميلويد، Orrú وآخرون. ووضعت استراتيجية لإزالة الموانع المحتملة لتشكيل اميلويد بتمشيط PrPSc إيمونوبريسيبيتيشن (IP) الخطوة و RT-قويك (2011)، والمسمى ” زيادة قويك ” المقايسة (إكويك). وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت خطوة استبدال الركيزة بعد ~ 24 ساعة وقت رد الفعل من أجل تحسين الحساسية. وفي نهاية المطاف، ك ag من الحزب الثوري الشعبياتفاقية استكهولم منخفضة 1 كان يمكن كشفها بواسطة إكويك 30.

من أجل تنقية مقتطفات البراز وإزالة مثبطات الإنزيم الممكنة في البراز، كانت تجانس عينات البراز التي جمعت في المراحل السريرية والسريرية من الأيائل على العدوى عن طريق الفم التجريبية في مخزن يحتوي على المنظفات ومثبطات البروتياز. كذلك قدمت مقتطفات البراز إلى منهجيات مختلفة تركيز PrPاتفاقية استكهولم في العينات التي تستخدم ترسيب البروتين عن طريق الصوديوم فوسفوتونجستيك هطول الأمطار الحمضية (ناتا). الأسلوب هطول الأمطار ناتا، وصف لأول مرة من صفر et al. 43، يستخدم لتركيز PrPاتفاقية استكهولم في عينات الاختبار. الحضانة ناتا مع نتائج العينة في هطول الأمطار التفضيلية PrPSc بدلاً من الحزب الثوريج. ومع ذلك، الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة. وساعدت هذه الخطوة أيضا احتواء ومنع التحويل التلقائي من ربرب، الذي لوحظ في بعض الحالات. أخيرا، تم اختبار مقتطفات البراز بالامثل RT-كويك استخدام الماوس ربرب (aa 23-231) كركيزة، بما في ذلك استبدال الركيزة في البروتوكول تحسين حساسية الكشف.

وتبين النتائج هنا أن هذه الطريقة تحسن يمكن الكشف عن تركيزات منخفضة جداً من البريونات CWD، ويزيد من حساسية الكشف والتحديد في عينات البراز مقارنة ببروتوكول دون استبدال هطول الأمطار والركيزة نابتا. يحتمل أن هذا الأسلوب يمكن تطبيقه على الأنسجة وسوائل الجسم الأخرى، ويمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لمراقبة CWD في سيرفيدس البرية والاسيرة.

Protocol

1-RT كويك “مواد البراز باستخدام” هوموجيناتي استخراج إعداد البراز سيرفيد جعل البراز بإضافة 1 غرام مواد البرازية 10 مل براز استخراج المخزن المؤقت (فوسفات الصوديوم 20 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1، 130 ملم كلوريد الصوديوم، 0.05% 20 توين، 1 مم بمسف والعاشر 1 إكمال مثبطات البروتياز، يدتا م?…

Representative Results

مقتطفات البراز CWD أعدت في 10% (w/v) تمكنوا من البذور RT كويك رد فعل، ومع ذلك كان الحساسية للكشف عن انخفاض 27. استخدام المخزن مؤقت محدد لتجانس البراز كان خطوة حاسمة لتفادي الأسفار خلفية عالية في ردود RT كويك الملازمة للاستخدام الماوس ربرب الركازة بدلاً من ربرب الغزلا…

Discussion

RT كويك كان يعمل على اكتشاف البريونات CWD في البول والبراز مقتطفات من الأبيض – الذيل الغزلان والوعول شفويا المصابة 38سابقا. النظام هو مبين في هذه المخطوطة أسلوب تكييف للمقايسة RT كويك. وأدرجت خطوات إضافية في مقايسة RT كويك “الكلاسيكية” لتحسين الكشف والحساسية للمقايسة البريونات CWD ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للدكتور بايرون كاوغيي (مختبرات الجبال الصخرية المعاهد الوطنية للصحة) لتوفير التدريب وبلازميد التعبير البكتيرية PrP سيرفيد. ويدعم البرنامج “كرسي أبحاث كندا” SG. نحن نعترف بتمويل هذه البحوث إلى سان جرمان من كندا، ألبرتا بريون أبحاث معهد الجينوم والبرتا الزراعة والغابات من خلال الجينوم ألبرتا، وجامعة كالغاري دعما لهذا العمل. نعترف بمنحه بحثية من مؤسسة “البحوث الحيوانية” غن مارغريت.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image