관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

Summary

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

Abstract

이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.

Introduction

바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.

헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제¹조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관련 된 바이러스 성 게놈 단백질의 종합 평가 하는 바이러스 성 게놈에 행동 하 고 있는 바이러스 및 세포질 요인에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 프로세스의 분자 세부 조사를 기초 누워 것입니다. 감염의 다양 한 단계에 포함 된다입니다.

바이러스 성 감염에 관련 된 호스트 요인의 조사에 대 한 이전 방법 포함 관련된 세포 단백질^2,3,,45 의 분석에 대 한 바이러스 성 단백질의 친 화력 정화 ^{, 6 , 7 , 8 , 9}. 이러한 분석 수단이 포함 된 세포질 요인의 식별에 대 한 호스트 항 바이러스 응답 뿐만 아니라 바이러스 chromatin 수정, 유전자 발현 및 DNA 복구. 그러나, 그것은 상호 작용 vDNA, 연관에 따라 달라 집니다 그리고 proteomics 특정 바이러스 성 요인의 기능으로 발생 하는 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공 여부를 확인 하기가 어렵습니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 특정 바이러스 및 세포질 단백질 바이러스 성 게놈^{10,11,12,,1314} 바인딩할 식별 하는 데 사용 되었습니다. ^{, 15} 그리고 형광 성 제자리 교 잡 (물고기) immunocytochemistry와 함께 vDNA^16,,1718, 와 colocalize 세포 요소의 시각화 수 있게 되었습니다. ^{19 , 20}.이 분석 실험 공간 및 시간 분석에 대 한 허용. 그러나, 한계는 매우 구체적인 항 체, 제한 된 감도 및 이전 통찰력 바이러스 호스트 상호 작용에 대 한 필요성에 대 한 필요성을 포함합니다. 우리는 따라서 iPOND (초기 DNA에 단백질의 격리)²¹ 에 따라 방법을 개발 및 선택적으로 레이블을 지정 하 고 정화에서 vDNA aniPOND (가속된 네이티브 iPOND)²² 감염 바이러스 성 게놈의 편견된 식별에 대 한 셀 관련된 단백질 질량 분석에 의해입니다. iPOND 세포 복제 포크 역학 조사에 대 한 수단이 되었습니다.

감염 된 세포에서 바이러스 성 게놈의 선택적 정화에 대 한 수정 ethynyl nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 또는 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (그림 1), 다음 화학식으로 표시 됩니다 vDNA 복제 통해 biotin 아 지 드를 활용 한 단계 바이러스 성 게놈 및 streptavidin 입히는 구슬 (그림 2B)에 관련 된 단백질의 정화를 촉진 하기 위하여 화학을 클릭 합니다. 중요 한 것은, 감염 vDNA의 특정 라벨 수 있도록 세포 DNA 복제에 종사 하지 않습니다 고정 된 셀에서 수행 됩니다. 또한, HSV-1 감염 세포 주기 검거 원인과 세포 DNA 복제^23,24를 억제 합니다. 바이러스를 들어오는 바이러스 성 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 또는 새로 합성된 vDNA (그림 1B)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 수 있습니다. ²⁵. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)²⁶와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, ethynyl 수정 vDNA 단백질 역동성 (그림 2A 및 그림 3)의 공간을 위해 fluorophore를 covalently 활용 될 수 있습니다. 이미징은 vDNA의 직접적인 시각화에 대 한 허용 및 vDNA-단백질 상호 작용의 유효성 검사에 대 한 무료 접근 이며 감염을 통해 바이러스 성 게놈을 추적 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리 예상 대기 시간 및 재 조직를 포함 하 여 herpesviral 감염의 어떤 양상 든 지 공부 하 고 다른 DNA 바이러스 연구를 이러한 접근 더 수정 될 수 있습니다. 또한, 5-ethynyl uridine로 (EU) RNA 바이러스 성 게놈의 분석에 대 한 허용할 수 있습니다.

Protocol

1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1) 다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 ' 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. MRC-5 셀 confluent 150 cm 2 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 …

Representative Results

세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드21에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 ?…

Discussion

이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및…

Materials

MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock			stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column)	GE Healthcare	17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C
Nuclear Extraction Buffer (NEB)			prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	Autoclave before use
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year
Click Reaction Mix			prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001	Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
freezing buffer			prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1			prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3			prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2X Laemmli sample buffer			Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
cap locks for 1.5 mL tube	Fisher Scientific	NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-well tissue culture dish	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave before use
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
mouse anti-ICP8 primary antibody	Abcam	ab20194	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)	Abcam	ab19311	Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x SDS-bicarb solution			2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol			mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol			mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks			65 °C and 95 °C