Ce protocole décrit les techniques d’évaluation de réticulation chimique de la sclérotique de lapin à l’aide de l’imagerie de la génération de seconde harmonique et calorimétrie différentielle à balayage.
Méthodes pour renforcer le tissu en introduisant des liaisons chimiques (réticulation non enzymatique) dans des protéines structurales (collagènes fibrillaires) pour la thérapie incluent la réticulation photochimique et tissus réticulation méthodes (TXL). Ces méthodes pour induire des changements de propriété tissu mécanique sont utilisées pour la cornée en amincissement cornéen (mécaniquement affaibli) troubles comme le kératocône, mais aussi la sclère dans la myopie progressive, où éclaircie et affaiblissement de la partie postérieure sclère se produit et contribue probablement à élongation axiale. Les protéines de la cible principale pour le renforcement de ces tissus sont des collagènes fibrillaires qui constituent la grande majorité des protéines de poids sec dans la cornée et la sclérotique. Fortuitement, collagènes fibrillaires constituent la principale source de deuxième génération harmonique de signaux dans l’espace extracellulaire du tissu. Donc, modifications des protéines de collagène, telles que celles induites par le biais de thérapies, la réticulation pourraient potentiellement être détectées et quantifiées par l’utilisation de la microscopie de génération d’harmoniques deuxième (SHGM). Surveillance SHGM signaux grâce à l’utilisation d’un laser à balayage système de microscopie couplée à une excitation infrarouge lumière source est une méthode d’imagerie moderne excitante qui jouit d’un usage répandu dans les sciences biomédicales. Par conséquent, la présente étude a été entreprise afin d’évaluer l’utilisation de la microscopie SHGM comme un moyen de mesurer a provoqué des effets réticulation dans ex vivo de sclère lapin, après une injection d’un produit chimique, agent de réticulation dans l’espace de la sub-Tenon (sT), un injection l’approche c’est une pratique courante pour causer d’anesthésie oculaire lors de procédures cliniques ophtalmologiques. Le produit chimique, agent de réticulation, hydroxyméthylglycinate de sodium (SMG), provient d’une classe de conservateurs cosmétiques appelée formaldéhyde libérant des agents (FAR). Sclérales changements après réaction avec SMG a entraîné une augmentation dans les signaux de la SHG et en corrélation avec des changements dans la température de dénaturation thermique, une méthode standard pour évaluer induite tissu effets de réticulation.
Myopie progressive est postulée pour être traitable par réticulation sclérale non enzymatique (photochimique et/ou chimiques), ce qui est logique étant donné que le blocage enzymatique réticulation de collagène peut augmenter la privation (FD) de forme expérimentale-induite 1de myopie. Elsheikh et Phillips2 a récemment examiné la faisabilité et le potentiel d’utilisation standard irradiation ultraviolets A (UVA)-riboflavine médiée par réticulation photochimique (également connu sous le nom du protocole de Dresde), en abrégé ici comme (riboflavine CXL) pour une stabilisation sclérale postérieure stopper une élongation axiale dans la myopie. Cette méthode photochimique a été utilisée avec succès pour traiter la déstabilisation de la surface antérieure de globe (c.-à-d., la cornée bombée) vue dans keratectasia kératocône et post-LASIK. Cependant, application du présent protocole CXL pour la sclère est entravée par questions liées aux difficultés d’accès à la sclère postérieure avec une source de lumière ultraviolette (UV), ainsi que la nécessité de modifier une beaucoup plus grande tissu surface. Qu’étant dit, l’approche CXL a été utilisé pour stopper l’élongation axiale sous forme visuellement privé lapins (par tarsorrhaphy), bien que plusieurs régions de la sclère postérieure tenu plusieurs zones distinctes de l’irradiation dans cette étude3. En revanche, l’injection d’un agent stabilisant chimique (p. ex., agent de réticulation) par l’intermédiaire de l’espace sT pourrait représenter un moyen plus simple de modifier la sclère postérieure, évitant la nécessité d’introduire une source de lumière UV. Cette technique d’injection est bien connue comme un moyen utile d’induire une anesthésie oculaire durant les interventions ophtalmologiques tels que cataracte chirurgie4,5,6. Wollensak7 a décrit précédemment l’utilisation d’une injection de sT à l’aide de glycéraldéhyde (un réticulation agent chimique semblable au concept de la formaldéhyde libérant des agents (FARs) décrites dans la présente étude) pour raidir le lapin sclérotique et la genipin a été montré pour limiter la longueur axiale en FD cobayes8,9. Ces chercheurs ont démontré un net avantage de l’utilisation d’un agent chimique soluble sur la technique CXL photochimique. Ainsi, sclérale réticulation à l’aide d’un agent chimique injectable d’un certain type, y compris le FARs (c.-à-d., TXL)10, pourrait fournir une méthode de traitement possible pour stopper la progression de l’élongation sclérale vue dans la myopie.
Dans les protocoles présentés ici, nous utilisons la solution réticulation chimique de sodium hydroxyméthylglycinate (SMG), administrée par injection de sT à la sclérotique des yeux de lapin provenant de cadavres. Nous avons mis en place des protocoles similaires précédemment pour la réticulation chimique topique dans la cornée. Notamment dans les études rapportées antérieurement, dépendante de réticulation des effets de la concentration pourrait être obtenue en utilisant des SMG, avec une gamme d’effet couvrant bien supérieure à celle possible avec des procédés photochimique CXL tel que déterminé par l’analyse de la dénaturation thermique11 .
Nous décrivons ici les protocoles visant à évaluer l’effet de réticulation de SMG envoyée via des injections de sT au tissu scléral, dénaturation thermique à l’aide de la calorimétrie à balayage différentielle (DSC) et deuxième de microscopie du génération harmonique (SHGM).
À l’aide d’analyse calorimétrique différentielle (DSC), également connu sous le nom de l’analyse thermique, une transition de dénaturation thermique est mesurée, qui pour tissu scléral est principalement guidé par les propriétés des collagènes fibrillaires, car ils constituent la majorité de vrac de la protéine. Cette méthode évalue la stabilité de la structure moléculaire de collagène et des liaisons réticulés qui stabilisent les fibrilles de collagène, la structure de la principale protéine tertiaire. Durant le chauffage dans le DSC, une température de transition critique est atteint qui entraîne la dénaturation de la molécule de collagène, entraînant dans le déroulement de la triple hélice, un processus qui se forme à ce qui est communément appelé gélatine. Cette dénaturation thermique perturbe les liaisons hydrogène le long de la molécule de collagène et peut être déplacée à des températures plus élevées par le biais de méthodes de réticulation induit12,13. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses décennies, particulièrement dans l’industrie des biomatériaux et des processus qui incluent la fabrication de cuir. Toutefois, cette méthode nécessite l’extraction du tissu sclérotique et ne peut donc être utile comme technique d’ex vivo .
Microscopie (SHGM) de la génération de seconde harmonique est basée sur les propriétés optiques non linéaires des matériaux particuliers, avec des environnements moléculaires non-centrosymétriques. Dans ces matières, lumière intense, par exemple lumière produit par laser, génère des signaux SHG, dans laquelle la lumière incidente est doublée en fréquence. Matières biologiques qui sont connus pour créer des signaux SHG sont le collagène, microtubules et myosine du muscle. Par exemple, le collagène excités par une lumière infrarouge de longueur d’onde de 860 nm émet un signal SHG dans le domaine du visible avec la longueur d’onde de 430 nm. Génération de seconde harmonique (SHG) signal imagerie est une méthode prometteuse pour l’évaluation de réticulation du collagène thérapeutique. On sait depuis plus de 30 ans que les fibrilles de collagène dans les tissus émettent SHG signaux14. Cependant, seulement récemment des images haute résolution pu15 dans une variété de tissus, y compris le tendon16, peau, cartilage,17,18de vaisseaux sanguins et collagène gels19.
Basé sur cette connaissance, cette étude évalue les changements de signal SHG induits dans la sclérotique par SMG induite chimiquement la réticulation du collagène. Les résultats indiquent que la modification de SMG de la sclère augmente les signaux SHG produites à partir de faisceaux de fibres de collagène des tissus (la plus haut ordre structure quaternaire composée de fibrilles de collagène) et produit également un changement structurel morphologique dans le collagène réseau de fibres optiques, reflété dans la fibre bundle « redressement. »
Expériences ont montré des preuves à l’appui de l’utilisation de la microscopie de signal SHG comme une méthode d’évaluation de collagène réticulation des effets dans la sclérotique, évoquant la possibilité future d’utiliser cette technique comme un outil de suivi pour les traitements de réticulation qui cible les protéines de collagène. À noter, un instrument est déjà en usage clinique pouvant potentiellement capturer ce signal SHG. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour l’i…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Tongalp Tezel, MD, pour consultation publique concernant l’injection de sT ; Theresa Swayne, PhD, pour consultation au sujet de la SHG microscopie ; et Jimmy Duong de la conception et de ressources de biostatistique et de l’installation de base de biostatistiques de l’Institut d’Irving à Columbia University Medical Center.
Prise en charge en partie par la recherche pour prévenir la cécité et par les instituts nationaux de santé subventions RRRNC UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 et NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possède une propriété intellectuelle connexe : US délivré des brevets no : 8 466 203 et aucun : 9 125 856. En attente de brevet international : PCT/US2015/020276.
Des images ont été recueillies dans le Confocal et spécialisé de ressources partagées de microscopie de l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center à l’Université de Columbia, pris en charge par les NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). La microscopie confocale a été achetée avec les NIH accorder #S10 RR025686.
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1 | |
Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2 | |
Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1 | |
Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2 |
Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements – protocol step 2.4 | |
DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4 | |
Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1. | |
GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1 |
Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11 | |
AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3 |
25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7 | |
A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8 | |
NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9 |
Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |