Второй гармонических поколения сигналов в кролика склеры как инструмент для оценки терапевтических ткани сшивки (TXL) для близорукости
Summary
Этот протокол описывает методы оценки химической сшивки кролик склеры, используя второй гармоники поколения изображений и дифференциальной сканирующей калориметрии.
Abstract
Методы укрепления тканей путем введения химических связей (неферментативного cross-linking) в структурных белков (фибриллярного коллагены) для терапии включают фотохимического cross-linking и ткани, сшивки (TXL) методы. Такие методы для стимулирования изменения свойств механических тканей используются для роговицы роговицы истончение (механически ослаблены) расстройств, как кератоконус склеры в прогрессирующей близорукости, где истончение и ослабление кзади Склера возникает и скорее всего способствует осевое растяжение. Основная цель белки для укрепления таких тканей являются фибриллярного коллагены, которые составляют подавляющее большинство белков сухого веса в роговицы и склеры. Случайно фибриллярного коллагены являются главным источником второй гармонических поколения сигналов в пространстве внеклеточной ткани. Таким образом изменения коллагеновых белков, таких как те, индуцированной через cross-linking терапии, потенциально может быть обнаружен и предел использования второй гармоники поколения микроскопии (SHGM). Мониторинг SHGM сигналов с помощью лазерного сканирования системы микроскопии в сочетании с инфракрасного света возбуждения, что источник интересных современных изображений метод, который наслаждается широкое использование в биомедицинских наук. Таким образом, настоящее исследование было проведено для того, чтобы оценить использование SHGM микроскопии, как средство для измерения индуцированной сшивки эффекты в ex vivo кролик склеры, после инъекции химического cross-linking агент в суб Tenon пространство (sT), инъекции подход это стандартная практика для нанесения глазной анестезии при офтальмологических клинических процедур. Химической сшивки агент, натрия hydroxymethylglycinate (SMG), — от класса косметические консерванты, известный как формальдегид, выпуская агентов («фарс»). Склеры изменения после реакции с SMG привела к увеличению SHG сигналов и коррелирует с изменениями в температуре тепловой денатурации, стандартный метод для оценки индуцированной ткани cross-linking эффекты.
Introduction
Прогрессирующая близорукость постулируется считаются излечимыми посредством неферментативного склеры сшивки (фотохимического и/или химических веществ), который имеет смысл, учитывая, что блокирование коллаген ферментативные cross-linking может увеличить экспериментальные формы лишения (FD)-индуцированной близорукость1. Инфекционную и Филлипс2 недавно обсуждали возможности и потенциал использования стандартной УФ А излучения (UVA)-рибофлавин опосредованной фотохимического сшивки (также известный как Дрезден протокол), сокращенно здесь как (рибофлавин CXL) для задней склеры стабилизации прекратить осевое растяжение в близорукости. Этот фотохимического метод успешно используется для лечения дестабилизации поверхности передней глобус (то есть, выпуклые роговицы), видели в keratectasia кератоконуса и пост LASIK. Однако применение этой CXL протокола для склеры препятствуют проблемы, связанные с трудностями в получении доступа к задней склеры с источником ультрафиолетового (УФ) света, а также необходимость изменения гораздо больше ткани площадью поверхности. Что сказал, CXL подход был использован чтобы остановить осевое растяжение в визуально форме лишено кроликов (Тарзорафия), хотя несколько областей задняя склеры требуется несколько отдельных облучения зон в этом исследовании3. Напротив инъекции химического стабилизирующим агента (то есть, сшивки агент) через sT пространства может представлять простой способ изменить задняя склеры, избегая необходимости введения источник ультрафиолетового света. Эта техника инъекции хорошо известен как полезный способ заставить глазной анестезии при офтальмологических процедуры, такие как Катаракта хирургии4,5,6. Wollensak7 описал ранее использование sT инъекции с помощью Глицеральдегид (химической сшивки агент схожая по концепции с формальдегидом, выпуская агентов (фарс), описанные в данном исследовании) застывать кролик склеры и genipin имеет был показан для ограничения осевой длина в FD морских свинок8,9. Эти исследователи продемонстрировали явное преимущество использования растворимых химического агента над фотохимического CXL технику. Таким образом, склеры сшивки с помощью инъекции химического агента некоторого типа, в том числе фарс (т.е., TXL)10, может предоставить метод лечения возможно остановить прогрессирование склеры удлинения, видели в близорукости.
В протоколах, представленные здесь мы используем химической сшивки раствор натрия hydroxymethylglycinate (SMG), через sT инъекции склеры глаз трупной кролика. Мы внедрили аналогичные протоколы ранее для актуальных химической сшивки в роговице. Особенно в этих исследованиях сообщалось ранее концентрация зависимых cross-linking эффекты могут быть получены с помощью SMG, с диапазоном эффект, охватывающих значительно выше, достижимые с фотохимическими CXL определяется тепловой денатурации анализа11 .
Здесь мы описываем протоколы для оценки сшивки эффект SMG, доставлено через sT инъекции склеры ткани, тепловой денатурации с помощью сканирования дифференциальной калориметрии (ДСК) и второй гармоники поколения микроскопии (SHGM).
С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), также известный как термический анализ, тепловой денатурации переход измеряется, который для склеры ткани является преимущественно, руководствуясь свойства фибриллярного коллагены, поскольку они составляют большинство массовых белка. Этот метод оценивает стабильность молекулярной структуре коллагена и сшитого облигации, которые стабилизировать фибрилл коллагена, структуры основных высших белков. Во время нагревания в DSC, критического переходного периода температура достигнута, приводит к денатурации коллагена молекулы, что приводит к разматывающее тройной спирали, процесс, который формирует то, что широко известен как желатин. Этот тепловой денатурации разрушает водородные вдоль молекулы коллагена и может быть перенесен в более высоких температурах посредством индуцированного сшивки методы12,13. Этот метод был использован для многих десятилетий, особенно в индустрии биоматериалов и для процессов, которые включают кожа решений. Однако этот метод требует извлечения склера ткани и поэтому может быть только полезным ex vivo технику.
Микроскопия генерации второй гармоники (SHGM) на основе нелинейных оптических свойств конкретных материалов, с не Центросимметричная молекулярных сред. Например в таких материалах, интенсивный свет, свет производства лазеров, генерирует сигналы ГСП, в которых падающего света в два раза частотой. Биологические материалы, которые известны для создания SHG сигналы являются коллаген, микротрубочки и миозина мышц. Например коллаген, возбужденных с инфракрасным излучением 860 нм длины волны будет излучать сигнал ГСП в видимом диапазоне с 430 Нм длины волны. Второй гармоники поколения (SHG) сигнал изображений является перспективным методом для оценки терапевтических коллагена сшивание. Более 30 лет было известно, что фибрилл коллагена в тканях излучают SHG сигналы14. Однако только недавно изображения с высоким разрешением можно15 в различных тканях, включая сухожилия16, кожи, хряща17,18кровеносных сосудов и коллагеновые гели19.
Основываясь на этом знании, данное исследование оценивает изменения сигнала ГСП, индуцированной в склеру через SMG химически индуцированных сшивания коллагена. Результаты показывают, что SMG модификация склеры увеличивает сигналы ГСП, производится из ткани коллагена расслоений (выше порядок Четвертичная структура состоит из фибрилл коллагена), а также производит структурных морфологических изменений в коллагена оптической сети, отражено в волоконно расслоение «выпрямление».
Protocol
Representative Results
Discussion
Проведенные эксперименты показали, подтверждающей использование микроскопии сигнала ГСП в качестве метода для оценки коллагена cross-linking эффекты в склеры, повышение будущие возможности использования этого метода как инструмент контроля для сшивки лечения Это целевых белков коллагена…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Tongalp Tezel, MD, для проведения консультаций относительно sT инъекций; Тереза Swayne, PhD, для проведения консультаций относительно SHG микроскопии; и Джимми Duong от дизайна и биостатистики ресурсов и Фондом Biostatistical ядро Ирвинг института в медицинский центр Колумбийского университета.
Поддержаны в части исследования, чтобы предотвратить слепоту и национальных институтов здравоохранения грантов NCRR UL1RR024156, EY019007 Р30 NEI, NCI Р30 CA013696 и NEI R01EY020495 (DCP). Колумбийский университет владеет связанные интеллектуальной собственности: патента США выданы без: 8,466,203 и не: 9,125,856. Международный патент: PCT/US2015/020276.
Изображения были собраны в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Конфокальный микроскоп был приобретен с низ Грант #S10 RR025686.
Materials
| MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V | EMD Millipore, Massachusetts, USA | Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1 | |
| Sodium hydroxymethylglycinate | Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA | Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2 | |
| Injection needle with luer-lock syringe | BD Eclipse, NJ, USA | Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1 | |
| Rabbit head | La Granja poultry | Outbred | Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2 |
| Tono-pen | Reichter Technologies Depew, NY | IOP measurements – protocol step 2.4 | |
| DSC 6000 Autosampler | Perkin-Elmer Waltham, MA, USA | Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4 | |
| Pyris software | Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA | Ver 11.0 | protocol step 7.5 |
| CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1. | |
| GenTeal | Alcon, Fort Worth, TX | B000URVDQ8 | Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1 |
| Chameleon Vision II | Coherent, Santa Clara,CA, USA | Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11 | |
| AttoFluor cell chamber | Thermo Fisher Scientific Inc | A7816 | Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3 |
| 25-mm round coverslips, #1.5 | Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA | GG-25-1.5 | protocol step 8.1.3 |
| Eclipse Ti-E | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | protocol step 8.1.4. | |
| Non-descanned (NDD) GaAsP detector | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7 | |
| A1R-MP laser scanning system | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8 | |
| NIS Elements software | Nikon Instruments, Melville, NY, USA | Ver 4.3 | refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9 |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | protocol step 9.1.2 | |
| NeuronJ | Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands | https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | Ver 14 | protocol step 9.2.8 |
Riferimenti
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
- Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control?. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
- Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
- Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon’s administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
- Guise, P. Sub-Tenon’s anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
- Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon’s capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
- Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
- Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
- Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
- Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
- Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
- da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
- Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
- Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94 (1986).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
- Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004 (2013).
- Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
- Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040 (2009).
- Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
- Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
- Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
- Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
- Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
- Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
- Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
- Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
- Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
- Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
- Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
- McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
- Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
- Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
- Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
- Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
- Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon’s cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
- Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon’s, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
- Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
- Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking–a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
- Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
- Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).
