Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia

Summary

Questo protocollo descrive le tecniche per la valutazione di reticolazione chimica dello sclera coniglio mediante generazione di seconda armonica imaging e Calorimetria a scansione differenziale.

Abstract

Metodi per rinforzare il tessuto introducendo legami chimici (cross-linking non enzimatica) in proteine strutturali (collageni fibrillari) per la terapia includono cross-linking fotochimico e cross-linking metodi (TXL) del tessuto. Tali metodi per indurre i cambiamenti di proprietà meccaniche del tessuto sono essere impiegati per la cornea nei disordini di assottigliamento corneale (meccanicamente indebolito) come cheratocono, nonché la sclera in miopia progressiva, dove diradamento e indebolimento del posteriore sclera si verifica e probabilmente contribuisce all’allungamento assiale. Le proteine bersaglio primario per tale rafforzamento del tessuto sono collageni fibrillari che costituiscono la grande maggioranza delle proteine di peso a secco nella cornea e sclera. Fortuitamente, collageni fibrillari sono la principale fonte di seconda generazione armonica segnali nello spazio extracellulare dei tessuti. Pertanto, modificazioni delle proteine del collagene, quali quelli indotti tramite cross-linking terapie, potenzialmente potrebbero essere rilevate e quantificate attraverso l’uso di microscopia di seconda generazione di armoniche (SHGM). Monitoraggio SHGM segnali attraverso l’uso di un sistema di microscopia accoppiato con un’eccitazione a infrarossi luce di scansione laser di origine è un metodo di imaging moderno emozionante che sta godendo l’uso diffuso nelle scienze biomediche. Così, lo studio presente è stato intrapreso per valutare l’uso di microscopia SHGM come un mezzo per misurare indotta cross-linking effetti ex vivo la sclera di coniglio, segue un’iniezione di una sostanza chimica agente reticolante nello spazio di sub-Tenon (sT), un iniezione di approccio che è pratica standard per causare anestesia oculare durante le procedure cliniche oftalmologiche. La chimica agente reticolante, sodio hydroxymethylglycinate (SMG), è da una classe di conservanti cosmetici conosciuto come formaldeide distaccanti (FARs). Cambiamenti scleral dopo reazione con SMG provocato gli aumenti in SHG segnali e correlati con i cambiamenti nella temperatura di denaturazione termica, un metodo standard per valutare indotta cross-linking effetti del tessuto.

Introduction

Miopia progressiva è postulata per essere curabile attraverso reticolazione scleral non enzimatici (fotochimica e/o chimica), che ha un senso dato che bloccando la reticolazione del collagene enzimatica può aumentare la privazione di forma sperimentale (FD)-indotta miopia¹. ElSheikh e Phillips² recentemente discusso la fattibilità e il potenziale di utilizzo standard irradiazione ultravioletta-A (UVA)-riboflavina mediata reticolazione fotochimica (noto anche come il protocollo di Dresda), abbreviato qui come (riboflavina CXL) per stabilizzazione scleral posteriore fermare allungamento assiale nella miopia. Questo metodo fotochimico è stato utilizzato con successo per il trattamento di destabilizzazione della superficie anteriore del globo (cioè, la cornea sporgente) vista in keratectasia cheratocono e alberino-LASIK. Tuttavia, applicazione del presente protocollo CXL per la sclera è ostacolata da questioni legate alla difficoltà di accesso alla sclera posteriore con una sorgente di luce ultravioletta (UV), come pure la necessità di modificare una molto tessuto superficie maggiore. Che essendo detto, l’approccio CXL è stato utilizzato per fermare allungamento assiale visivamente modulo privato conigli (da tarsorrhaphy), anche se le regioni multiple di sclera posteriore richiesto più zone di irradiazione separati in quello Studio³. Al contrario, l’iniezione di un agente chimico di stabilizzazione (cioè, agente reticolante) tramite lo spazio di sT potrebbe rappresentare un modo più semplice per modificare la sclera posteriore, evitando la necessità di introdurre una fonte di luce UV. Questa tecnica di iniezione è ben nota come un modo utile di indurre anestesia oculare durante le procedure oftalmologiche ad esempio cataratta chirurgia^4,5,6. WOLLENSAK⁷ ha descritto in precedenza l’uso di un’iniezione di sT utilizzando gliceraldeide (un cross-linking agente chimico simile nel concetto alla formaldeide distaccanti (FARs) descritti in questo studio) per irrigidire il coniglio sclera e Genipina ha dimostrato di limitare la lunghezza assiale in FD cavie^8,9. Questi ricercatori hanno dimostrato un chiaro vantaggio dell’utilizzo di un agente chimico solubile rispetto la tecnica CXL fotochimica. Così, scleral reticolazione utilizzando un agente chimico iniettabile di qualche tipo, tra cui la FARs (cioè, TXL)¹⁰, potrebbe fornire un metodo di trattamento fattibile per arrestare la progressione dell’allungamento scleral visto nella miopia.

Nei protocolli presentati qui, usiamo una soluzione reticolazione chimica di sodio hydroxymethylglycinate (SMG), consegnata tramite iniezione sT allo sclera degli occhi di coniglio cadaverico. Abbiamo implementato protocolli simili precedentemente per la reticolazione chimica d’attualità nella cornea. In particolare in quegli studi precedentemente segnalati, concentrazione-dipendente di cross-linking effetti poteva essere ottenuta utilizzando SMG, con un intervallo di effetto che si estende ben superiore a quella ottenibile con CXL fotochimica, come determinato mediante analisi di denaturazione termica¹¹ .

Qui descriviamo protocolli per valutare l’effetto di cross-linking di SMG consegnati tramite iniezioni di sT al tessuto sclerale, denaturazione termica mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC) e la seconda armonica generazione microscopia (SHGM).

Mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC), noto anche come analisi termica, una transizione di denaturazione termica è misurata, che per il tessuto sclerale è prevalentemente guidato dalle proprietà di collageni fibrillari, poiché essi costituiscono la maggioranza di massa della proteina. Questo metodo consente di valutare la stabilità della struttura molecolare del collagene e i legami cross-linked che stabilizzano le fibrille di collagene, la struttura principale e terziaria della proteina. Durante il riscaldamento nel DSC, si raggiunge una temperatura di transizione critica che provoca la denaturazione della molecola del collagene, con conseguente srotolamento della tripla elica, un processo che forma ciò che è comunemente noto come gelatina. La denaturazione termica interrompe legami idrogeno lungo la molecola di collagene e può essere spostata a temperature più elevate attraverso indotta cross-linking metodi^12,13. Questo metodo è stato utilizzato per molti decenni, in particolare nel settore dei biomateriali e per i processi che includono cuoio-fare. Tuttavia, questo metodo richiede l’estrazione del tessuto sclera e pertanto può essere solo utile come tecnica di ex vivo .

Microscopia di generazione di seconda armonica (SHGM) si basa sulle proprietà ottiche non lineari di materiali particolari, con ambienti molecolare non-centrosimmetrici. In tale materiale, luce intensa, ad esempio luce prodotta dai laser, genera segnali SHG, in cui la luce incidente è raddoppiata in frequenza. Materiali biologici che sono noti per creare segnali SHG sono collagene, microtubuli e miosina muscolare. Ad esempio, collagene eccitato con una luce infrarossa di lunghezza d’onda di 860 nm emette un segnale SHG nel campo visibile con lunghezza d’onda di 430 nm. Seconda generazione armonica (SHG) segnale imaging è un promettente metodo per valutare la reticolazione del collagene terapeutico. Esso è stato conosciuto per più di 30 anni che le fibrille di collagene nei tessuti emettono SHG segnali¹⁴. Tuttavia, solo recentemente immagini ad alta risoluzione si otteneva¹⁵ in una varietà di tessuti, compreso il tendine¹⁶, pelle, cartilagine¹⁷, vasi sanguigni¹⁸e in collagene gel¹⁹.

Basati su questa conoscenza, questo studio valuta i cambiamenti del segnale SHG indotti nella sclera attraverso SMG chimicamente indotta cross-linking del collagene. I risultati indicano che SMG modifica dello sclera aumenta i segnali SHG prodotti da fasci di fibre collagene del tessuto (il più alto ordine struttura quaternaria composta da fibrille collagene) e produce anche un cambiamento morfologico strutturale del collagene rete in fibra ottica, riflessa in fibra bundle “raddrizzare”.

Protocol

Tutte le procedure sono state effettuate utilizzando gli occhi dei conigli cadaverico all’interno di teste di coniglio nazionali intatto. Sono state seguite tutti istituzionale e nazionale le linee guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. preparazione delle soluzioni Preparazione di SMG per TXL: Preparare 1 mL di concentrazione di 0,2 M di soluzione di bicarbonato di sodio soluzione (NaHCO3) utilizzando 0,0165 g di NaHCO3 polvere disciolta in 1 mL…

Representative Results

Temperatura di denaturazione termica (Tm) come un metodo di dosaggio per valutare TXL cross-linking effetto: Un totale di 16 paia di occhi di coniglio sono stati utilizzati in questi esperimenti per la procedura TXL. Come una parte iniziale di questo studio, è stata valutata la localizzazione di cross-linking effetto indotto tramite una singola iniezione di agente reticolante SMG via sT spazio alla testa di coniglio cadaverico. Questo tipo di esperimento ha rilevanza per…

Discussion

Esperimenti condotti hanno dimostrato la prova sostiene l’uso di microscopia SHG segnale come un metodo per la valutazione di cross-linking effetti sclera, sollevando la possibilità futura di usare questa tecnica come strumento di monitoraggio per trattamenti di cross-linking del collagene che destinazione proteine del collagene. Della nota, uno strumento è già in uso clinico che potenzialmente in grado di catturare questo segnale SHG. Anche se questo strumento è stato progettato principalmente per imaging derma di p…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8