Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben
Summary
Wir beschreiben die Blätterteig-Technik, durch die pharmakologische Reagenzien können während der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verabreicht werden, und verschiedene Aspekte der Funktionen, die für den Erfolg entscheidend sind.
Abstract
Pharmakologische Verwaltung wird häufig verwendet, wenn Sie ganze Zelle Patch-Clamp in Hirnschnitten Aufnahme durchführen. Eine der besten Methoden der Zulassungsantrag bei der elektrophysiologischen Aufnahme ist der Blätterteig-Technik, die verwendet werden kann, um die Wirkung der pharmakologischen Reagenzien auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben zu studieren. Der größte Vorteil der Blätterteig-Anwendung ist, dass die Wirkstoffkonzentration rund um den Ort der Aufnahme schnell erhöht und verhindert so die Desensibilisierung von Membranrezeptoren. Erfolgreichen Einsatz von Blätterteig Anwendung beinhaltet besondere Aufmerksamkeit auf die folgenden Elemente: die Konzentration des Medikaments, die Parameter der Blätterteig Mikropipette, der Abstand zwischen der Spitze des einen Blätterteig Mikropipette und das Neuron aufgenommen und die Dauer und Druck der Zug fahren (Pfund pro Quadratzoll, Psi). Dieser Artikel beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Erfassung der ganzen Zelle Ströme induziert durch Gamma – Aminobuttersäure (GABA) auf ein Neuron eine präfrontalen kortikalen Scheibe schnaufend. Insbesondere kann das gleiche Verfahren mit geringfügigen Änderungen, andere Hirnareale wie Hippocampus und das Striatum und verschiedene Präparate, wie z. B. Zellkulturen angewendet werden.
Introduction
Die Patch-Clamp-Technik, ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von elektrischen Signale in Neuronen, wurde in den 1970er Jahren1,2entwickelt. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie wissen wie bestimmte Behandlungen bietet (z. B. pharmakologische) neuronale Funktionen oder Kanäle in Echtzeit3verändern kann. Pharmakologische Bewertung der neuronalen Funktion während der gesamten-Zelle in einer Gehirn-Scheibe Aufzeichnung erfordert die Anwendung von Medikamenten, wie z. B. Agonisten oder Antagonisten von spezifischen Rezeptoren, die Neuronen aufgenommen wird. Diese Methode ermöglicht die Identifikation von neuronalen Veränderungen, die auftreten, nach der Anwendung eines bestimmten Medikaments, führt zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen-4. Obwohl pharmakologische Verwaltung über entweder Perfusion5 oder Blätterteig6durchgeführt werden kann, ist letzteres die überlegene Technik. Insbesondere: (i) Blätterteig Anwendung rasch erhöht Medikament Konzentration um das aufgezeichnete Neuron auf ein Niveau, so dass Desensibilisierung der Membranrezeptoren verhindert wird; (Ii) das Volumen der Droge aufgeblasen ist äußerst gering, so dass es kaum Auswirkungen auf die Bad-Lösung, die daher Nebenwirkungen der verabreichten Chemikalien auf Gehirnscheiben reduziert; (Iii) das Blätterteig-Protokoll kann eingestellt und gespeichert, so dass das Experiment sehr genau reproduzierbar; (iv) Blätterteig Anwendung steht für sparsamen Umgang mit Agonisten/Antagonisten, besonders wo solche Reagenzien sind teuer oder schwer zu erlangen.
Hier konzentrieren wir uns auf die ganze Zelle Ströme induziert durch schnaufend GABA in akut bereit Gehirnscheiben, ein Präparat, das hat den Vorteil, relativ gut erhaltene Hirnschaltkreisen Aufnahme. Wie führen wir Blätterteig-induzierte hemmenden Strömungen7 werden in diesem Artikel beschrieben werden. Mithilfe von Cäsium (Cs+)-interne Lösungen, und halten die Neuronen bei 0 mV, präsentieren wir GABA-Blätterteig hervorgerufen inhibitorischen postsynaptischen Ströme (eIPSCs) mit entsprechenden technischen Details. Mit einem Maus-Modell der Depression induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) Injektion8, wir zeigen, dass die eIPSC ist Amplitude, hervorgerufen durch einen GABA-Zug in Scheiben von LPS injiziert Mäusen im Vergleich zu Kontrollen Fahrzeug deutlich reduziert. Unsere Absicht ist, dass dieser Artikel zeigen sollte, wie die Blätterteig-Technik ist überall anwendbar, Studien zur Bewertung der Wirkung von Chemikalien, Verbindungen oder Drogen auf neuronalen Aktivitäten im Gehirnscheiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blätterteig-Anwendung ist weit verbreitet, postsynaptischen Rezeptor-Funktion3,4,7zu bewerten, sondern erfordert eine präzise Steuerung in jedem Experiment. Wir beschreiben hier ein Verfahrens unter Beteiligung ganz-Zell-Patch zu spannen, was beweist, dass GABA-Blätterteig IPSCs (z.B. eIPSCs) im präfrontalen kortikalen Gehirnscheiben induziert. Der Widerstand der Elektrode Aufnahme beträgt ca. 5 MΩ, während der Kopfkreis …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die folgenden Organisationen danken: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), der Wissenschaft und Technik Abteilung Guangdong (2013KJCX0054), der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou Wissenschaft und Technologie Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
Riferimenti
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