Vurdering af blod - hjerne barrieren permeabilitet af intravenøs Infusion af FITC-mærket Albumin i en musemodel af neurodegenerativ sygdom
Summary
I denne undersøgelse præsenterer vi en let og effektiv procedure til evaluering af forstyrrelser af blod – hjerne barrieren neurodegenerative betingelser. For at nå vores mål, vi infunderes høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat mærket (FITC)-albumin i mus jugularis vene og vurderet dets lækage i hjernen parenkym af Fluorescens mikroskopi.
Abstract
Afbrydelse af blod – hjerne barrieren (BBB) integritet er et fælles træk for forskellige neurologiske og neurodegenerative sygdomme. Selv om samspillet mellem foruroliget BBB homøostase og patogenesen af hjernen lidelser har brug for yderligere undersøgelse, kan udvikling og validering af en pålidelig procedure til præcist afsløre BBB ændringer være afgørende og repræsenterer en nyttig værktøj for potentielt forudsige sygdom målrettet progression og udvikling af terapeutiske strategier.
Her præsenterer vi en let og effektiv procedure for evaluering BBB lækage i neurodegenerative tilstand, som det forekommer i en prækliniske musemodel af Huntingtons sygdom, hvor fejl i permeabilitet af BBB er klart påviselige precociously i sygdommen. Specifikt, den høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat mærket (FITC)-albumin, som er i stand til at krydse BBB kun når sidstnævnte er nedsat, er akut infunderet i en mus halsfedt og dens fordeling i distrikterne vaskulære eller parenkymalt bestemmes derefter af Fluorescens mikroskopi.
Ophobning af grøn fluorescerende-albumin i hjernen parenkym fungerer som et indeks af afvigende BBB permeabilitet, og når quantitated ved hjælp af billede Jørgensen forarbejdning software, er rapporteret som grøn fluorescens intensitet.
Introduction
Homøostase i centralnervesystemet (CNS) er en forudsætning for korrekt kommunikation og funktionen af de neuronale celler. CNS parenkym er stramt afspærret fra periferien af i endothelial blod – hjerne barrieren (BBB), som repræsenterer grænsefladen mellem de perifere blodbanen og hjernen og spiller en central rolle i cross-talk mellem disse to distrikter1 ,2. BBB er en kompleks og dynamisk tredimensional struktur hovedsagelig består af specialiserede mikro-fartøj endotelceller (ECs) knyttet til hinanden gennem intercellulære junctional komplekser – stramme kryds (TJs) – og omgivet af pericytes, neuron slutninger og astrocyte fod processer1,2.
Fysiologiske betingelser, ekstremt lav permeabilitet af intakt BBB sikrer en streng regulering af transport af næringsstoffer og andre molekyler ind og ud af hjernen, og giver CNS med en enestående beskyttelse mod ændringer i de sammensætning af blodet, som kan påvirke neurale aktivitet og mod potentiale perifere fornærmelser1,2,3.
Afbrydelse af BBB integritet og dets øget permeabilitet har længe været kendt at udgøre et centralt element for mange neurologiske og neurodegenerative lidelser4 herunder Huntington’s chorea (HD)5,6, men , uanset om sådan en dysfunktion er en forårsagende fænomen eller en propagative begivenhed i sygdomsforløbet er stadig uklart. Timingen af BBB opdeling er også fortsat undvigende, men nye beviser af vores gruppe og andre angiver forstyrret BBB integritet ikke repræsenterer en sen begivenhed i sygdomsprogression, men snarere et tidligt trin6,7 , 8, der kan have langsigtede konsekvenser.
Med dette i tankerne er det vigtigt at precociously afsløre BBB opdeling i neurodegeneration for at udvikle strategier nyttigt at forudsige sygdomsprogression og hjerneskade og udvikle alternative og mere målrettede interventioner i stand til med succes afbøde de kliniske konsekvenser af sådanne forstyrrelser. Pålidelig billeddannelse af BBB værdiforringelse er derfor af stor betydning i både eksperimentelle forskning og kliniske behandling af hjernesygdomme.
I dette papir beskriver vi en vellykket og enkel procedure for evaluering af BBB permeabilitet i en HD musen model ved hjælp af en høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat mærket-albumin (FITC-albumin). Ekstravasation af FITC-albumin, som normalt ikke kan krydse barrieren, ind i hjernen parenkym blev målt som et indeks af BBB lækage. Denne teknik er let at tilpasse til rotter og andre patologiske tilstande præget af cerebrovasculature værdiforringelse9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den teknik vi beskrive her er primært nyttig til påvisning af BBB lækage under hjernen sygdomstilstande. BBB dysfunktion er ved at vinde opmærksomhed som en fælles funktion af forskellige neurologiske sygdomme4. Vi har tidligere brugt denne metode til at beskrive den tidlige derangement af BBB integritet i en musemodel af en sjælden neurodegenerativ sygdom som HD6.
Denne metode tager fordel af den relative enkelhed og effektivitet af den pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af “Fondazione Neuromed” og finansieret af det italienske sundhedsministerium “Ricerca Corrente” til V.M.
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
Riferimenti
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
