הערכה של חדירות מחסום הדם - מוח על ידי עירוי תוך ורידי של התווית על-ידי FITC אלבומין במודל של עכברים של מחלות ניווניות
Summary
במחקר זה, אנו מציגים הליך קל ויעיל להערכת שיבוש מחסום הדם – מוח ניווניות בתנאים. כדי להשיג את המטרה שלנו, אנחנו חדורים משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין לתוך וריד הצוואר העכבר הווריד וההערכה שלה דליפה לתוך parenchyma המוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
Abstract
שיבוש שלמות מחסום הדם – מוח (BBB) היא תכונה נפוצה עבור נוירולוגיות ומחלות ניווניות שונות. למרות יחסי הגומלין בין הומאוסטזיס BBB מודאג בפתוגנזה של הפרעות מוח צריך חקירה נוספת, פיתוח, אימות של שגרה אמין במדויק לזהות שינויים BBB עשוי להיות מכריע ומייצגים כלי שימושי פוטנציאל לחיזוי מחלות התקדמות, פיתוח ממוקד אסטרטגיות טיפוליות.
כאן, אנו מציגים את הליך קל ויעיל להערכת BBB דליפה לידי מצב ניווניות כאלה המתרחשים במודל של עכברים פרה של מחלת הנטינגטון, שבה פגמים החדירות של BBB הם בבירור לזיהוי precociously ב המחלה. באופן ספציפי, משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין, אשר מסוגל לעבור BBB רק כאשר האחרון הוא לקוי, הוא בחריפות מוחדר לתוך וריד הצוואר העכבר והפצתם המחוזות לכלי הדם או parenchymal לאחר מכן נקבע על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
הצטברות של פלורסנט-אלבומין ירוק ב- parenchyma המוח מתפקד בתור אינדקס של חדירות BBB סוטה ו, כאשר quantitated באמצעות תוכנת עיבוד תמונה J, המדווח עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק.
Introduction
הומאוסטזיס בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא תנאי מוקדם תקשורת מתאימה והתפקוד של תאים עצביים. CNS parenchyma בחוזקה סגור מהפריפריה מאת אנדותל מחסום הדם – מוח (BBB), אשר מייצג את הממשק בין מחזור הדם ההיקפיים המוח ממלא תפקיד מרכזי ב- cross-השיחה בין ברבעים אלה שני1 ,2. BBB היא מורכבת, דינמי המבנה התלת-ממדי מורכב בעיקר כלי מיקרו אנדותל תאים מיוחדים (ECs) קשורות זו לזו דרך מכלולי המערכת מהחיבור – צמתי צר (TJs) – והיא מוקפת pericytes, תא עצב סופים, אסטרוציט רגל תהליכים1,2.
בתנאים פיזיולוגיים, החדירות נמוך ביותר של BBB שלם מבטיחה ברגולציה קפדנית של הובלת חומרים מזינים ומולקולות אחרות החוצה את המוח, ומספק מערכת העצבים ייחודי להגנה מפני שינויים המתרחשים הרכב הדם אשר עשויים להשפיע על פעילות עצבית ונגד פוטנציאל היקפיים מעליב1,2,3.
שיבוש שלה חדירות משופרת של BBB תקינות יש כבר זמן רב ידוע מהווה תכונה מרכזית עבור רבים נוירולוגי ו4 כולל מחלת הנטינגטון (HD)5,6, אולם הפרעות ניווניות , אם תפקוד לקוי שכזה היא תופעה סיבתי או אירוע propagative במהלך המחלה עדיין לא ברור. העיתוי של BBB התמוטטות גם שרידים חמקמק, עם זאת, ראיות על ידי הקבוצה שלנו ואחרים המתעוררים מציין כי שלמות BBB שיבשו אינו מייצג מאוחר אירוע התקדמות המחלה, אבל מעדיף שלב מוקדם6,7 , 8, אשר עשויות להיות השלכות לטווח ארוך.
עם זאת, חשוב לחשוף התמוטטות BBB הקשורים ניוון מוחיים precociously כדי לפתח אסטרטגיות שימושית כדי לחזות את התקדמות המחלה, נזק מוחי או לפתח התערבויות אלטרנטיביות וממוקדות יותר מסוגל בהצלחה מקלים את ההשלכות כגון הפרעה קלינית. הדמיה אמין של BBB ליקוי הוא, לכן, חשיבות רבה במחקר ניסיוני והן ניהול קלינית של מחלות המוח.
בנייר זה, אנו מתארים הליך מוצלח ופשוט על ההערכה של BBB חדירות במודל של עכברים HD באמצעות את משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג-אלבומין (FITC-אלבומין). Extravasation של FITC-אלבומין, אשר בדרך כלל לא יכול לחצות את המחסום, אל parenchyma המוח נמדדה כמו אינדקס של BBB דליפה. טכניקה זו ניתנת להתאמה בקלות חולדות, מצבים פתולוגיים אחרים מאופיין cerebrovasculature ליקוי9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
נתאר כאן את הטכניקה שימושית בעיקר לגילוי BBB זליגת בתנאים מחלת מוח. תפקוד לקוי של BBB הוא צובר תשומת לב כמו תכונה נפוצה של הפרעות רגשיות ונוירולוגיות שונות4. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי לתאר את בלבול מוקדם של BBB שלמות במודל של עכברים של מחלה נדירה ניווניות כמו HD6.
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הזאת הייתה הנתמך על-ידי “דל’אנג’לו Neuromed”, במימון משרד הבריאות “החיפוש אחר Corrente” כדי V.M. איטלקית
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
Riferimenti
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
