Vurdering av blod - hjerne barrieren permeabilitet av intravenøs infusjon av FITC-merket Albumin i en musemodell av nevrodegenerative sykdommer
Summary
I denne studien presenterer vi en enkel og effektiv fremgangsmåte for å vurdere avbrudd i blod – hjerne barrieren under neurodegenerative forhold. For å oppnå våre mål, vi tilført molekylvekt fluorescein isothiocyanate merket (FITC)-albumin i musen vena vene og vurdert lekkasje i hjernen parenchyma av fluorescens mikroskopi.
Abstract
Avbrudd av blod – hjerne barrieren (BBB) integritet er vanlig for ulike nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer. Selv om samspillet mellom plaget BBB homeostase og patogenesen av hjernen lidelser må videre undersøkelser, kan utvikling og validering av en pålitelig prosedyre å nøyaktig oppdage BBB endringer være avgjørende og representerer et nyttig verktøy for potensielt forutsi sykdom målrettet progresjon og utvikle strategier.
Her presenterer vi en enkel og effektiv fremgangsmåte for å vurdere BBB lekkasje i nevrodegenerative betingelse som forekommer i en prekliniske musemodell Huntingtons sykdom, der feil i permeabilitet av BBB er klart synlig precociously i sykdommen. Spesielt den molekylvekt fluorescein isothiocyanate merket (FITC)-albumin, som er å krysse BBB bare når sistnevnte er svekket, er akutt infundert i en mus vena jugularis og distribusjon i distriktene vaskulær eller parenchymal deretter bestemmes fluorescens mikroskopi.
Akkumulering av grønne fluorescerende-albumin i hjernen parenchyma fungerer som en indeks av avvikende BBB permeabilitet og når quantitated ved hjelp av Image J bearbeiding programvare, rapporteres som Green fluorescens intensitet.
Introduction
Homeostase i sentralnervesystemet (CNS) er en forutsetning for riktig kommunikasjon og funksjonen til nevronale cellene. CNS parenchyma er tett forseglet fra periferien av den endothelial blod – hjerne barrieren (BBB), som representerer grensesnittet mellom eksterne blodet og hjernen og spiller en avgjørende rolle i kryss-snakk mellom disse to distriktene1 ,2. BBB er en kompleks og dynamisk tredimensjonal struktur bestående hovedsakelig av spesialiserte mikro-fartøy endotelceller (ECs) knyttet til hverandre gjennom intercellulære junctional komplekser – stramt veikryss (TJs) – og omgitt av pericytes, Nevron avslutninger og astrocytter foten prosesser1,2.
Under fysiologiske forhold, ekstremt lav permeabilitet av intakt BBB sikrer streng regulering av transport av næringsstoffer og andre molekyler inn og ut av hjernen, og gir en unik beskyttelse mot omveltningene i CNS den sammensetning av blod som kan påvirke nevrale aktivitet og potensial eksterne fornærmelser1,2,3.
Avbrudd av BBB integritet og sin økt permeabilitet har lenge vært kjent å utgjøre en viktig funksjon for mange nevrologiske og nevrodegenerative lidelser4 inkludert Huntingtons sykdom (HD)5,6, men , om slike en dysfunksjon er et fenomen som forårsaker eller en propagative hendelse i løpet av sykdommen er fortsatt uklart. Tidspunktet for BBB oversikt også forblir unnvikende, men nye bevis av vår gruppe og andre viser at forstyrret BBB integritet ikke representerer en sen hendelse i sykdomsprogresjon, men heller et tidlig trinn6,7 , 8, som kan ha langsiktige konsekvenser.
Med dette i tankene er det viktig å precociously avsløre BBB sammenbrudd i neurodegeneration for å utvikle strategier nyttig å forutsi sykdomsprogresjon og hjerneskade og utvikle alternative og mer målrettede tiltak kan lykkes dempe klinisk konsekvensene av slike avbrudd. Pålitelig imaging BBB verdifall er derfor av stor betydning både eksperimentell forskning og klinisk behandling av brain sykdommer.
I dette papir beskriver vi en vellykket og enkel prosedyre for vurdering av BBB permeabilitet i en HD musemodell ved hjelp av høy molekylvekt fluorescein isothiocyanate merket-albumin (FITC-albumin). Bloduttredelse av FITC-albumin, som normalt ikke krysse barrieren, i hjernen parenchyma ble målt som en indeks av BBB lekkasje. Denne teknikken er lett tilpasses rotter og andre pathological betingelser preget av cerebrovasculature verdifall9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikken vi beskriver her er spesielt nyttige for å oppdage BBB lekkasje under hjernen sykdom forhold. BBB dysfunksjon er å få oppmerksomhet som en vanlig funksjon i ulike nevrologiske lidelser4. Vi har tidligere brukt denne tilnærmingen for å beskrive den tidlige sinnsforvirring BBB integritet i en musemodell av en sjelden nevrodegenerative sykdommer som HD6.
Denne metoden tar nytte av den relative enkelheten og effektiviteten av prosedyre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av “Fondazione Neuromed” og finansiert av italiensk helse “Ricerca Corrente” til V.M.
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
Riferimenti
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
