本协议描述了一种用于开发人脑的 Zika 病毒感染模型的技术。利用野生或工程化的干细胞系, 研究人员可以利用这种技术来发现可能影响早期脑部感染的各种机制或治疗方法, 并在 Zika 病毒感染的胚胎中产生小头。
最近 Zika 病毒 (ZIKV) 在易感人群中的出现导致了新生儿小头和其他神经发育状况的突然增加。虽然蚊子是病毒传播的主要途径, 但它也被证明通过性接触和垂直 mother-to-fetus 传输传播。在后一种情况下的传输, 由于独特的病毒取向的 ZIKV, 该病毒被认为是主要目标的神经祖细胞 (npc) 发展的大脑。
这里描述了 ZIKV 感染的建模方法, 以及当人类大脑 organoids 暴露于活 ZIKV 时产生的小头。organoids 在其神经祖群中显示高水平的病毒, 并随着时间的推移表现出严重的细胞死亡和小头。这个三维脑化模型允许研究人员进行物种配对实验, 观察和潜在干预与发展中的人脑的 ZIKV 感染。该模型提供了改进的相关性比标准 two-dimensional 方法, 并包含了人类特有的细胞结构和蛋白表达, 是不可能的动物模型。
Zika 病毒 (ZIKV) 迅速蔓延在密克罗尼西亚, 法属波利尼西亚和美洲, 最近被证明跨越胎盘屏障1,2感染发育中的胎儿大脑, 导致神经发育疾病, 如作为小头3,4,5,6 。长期影响这些患者的生活, 目前缺乏治疗, 导致研究人员和临床医生, 以争夺更好地了解的机制背后的 ZIKV 感染和复制。以往的研究已经检查了 ZIKV 感染的体外系统在各种生理相关的细胞类型7,8,9, 以及在体内10与免疫和免疫缺陷小鼠11,12,13和非人类灵长类动物141516。除了这些更传统的技术, 几个小组已经实施干细胞衍生脑 organoids, 以了解更多关于 ZIKV 感染的发展中的人脑。这些组已利用人脑 organoids 确认小头表型17,18, 调查与病毒条目相关的受体19, 检查对感染的生理反应20,21, 潜在的筛选药物候选者22。这里描述了一种快速产生和感染干细胞衍生脑 organoids 的技术, 如前所示19, 以提高对发展中人脑的 ZIKV 感染的认识。
由于 organoids 是由标准多能干细胞 (PSC) 培养而成的, 因此这种技术可以对发展中的大脑的病毒感染问题进行各种科学的解答。例如, CRISPR 工程可用于在化感染之前以更快的速度修改这些 PSC 线, 而不是大多数在体内遗传研究19。另外, 与标准二维 (2D) 分化培养不同, organoids 展示了复杂的细胞结构, 这对 corticogenesis 是至关重要的, 最近的研究表明, 这种体系结构可能在感染时被破坏。21。最后, 相对于体内模型而言, 生成 organoids 的成本较低, 可以进行更高的吞吐量试验和筛选。另一方面, organoids 在 ZIKV 研究中的运用也存在一些弊端。虽然 organoids 比2D 文化更具生物学意义, 但由于其三维 (3D) 的性质, 在 organoids 的评估中还有其他的挑战。organoids 的成像和离解往往涉及更多的设备和比标准2D 文化更大的资源投资。此外, organoids 缺乏的血管和免疫成分存在于体内模型, 因此, 研究人员对这些方面的病毒感染建议寻求一个替代协议。
在文化中有许多技术来形成人类的 organoids 和球, 它们通常属于图案或unpatterned类别。图案化方法实现了调节 Wnt、BMP、TGFβ和其他信号通路的因素, 以将分化推向特定的血统23。Unpatterned 方法, 如这里描述的, 利用诱导的多能干细胞 (干细胞) 和人类胚胎干细胞 (干细胞) 的倾向, 以区别于神经血统的默认24。经过大约三周的分化, 由此产生的 organoids 包括大型, 仿生上皮结构, 包含几个细胞类型, 在早期发育的大脑中观察到。
提出了从标准、无饲养的 PSC 文化中生产 organoids 的技术, 并将这些 organoids 与 ZIKV 进行了充分的研究。关于无馈线公司所需的培养方法的指导, 请参阅以前的方法出版物25,26。此外, 为了在多个实验中应用一致的病毒数量, 重要的是要提前计算语言教学。这是通过进行感染的维罗细胞, 其次是治疗的叠加培养基, 孵化, 和免疫。此技术的描述和方法以前已被描述为19,27。
一旦 PSC 文化达到 50%-70% 的目标汇流, 细胞就会被离解并聚集到超低附着的 96-井板中。细胞被维护3天在无异的干细胞维护媒介 (委员会), 然后转换成神经归纳媒介为文化的剩下的人。一旦 organoids 有分化3周, 感染可以进行。通过在感染后一周内例行拍摄图像, 研究人员将观察化细胞的渐进性死亡和破坏。研究人员也可能在这个时候分离 organoids 进行转录或蛋白质组分析。Cryosectioning 和 lightsheet 方法是建议的成像, 研究人员可以期望看到高水平的感染和病毒复制, 特别是在神经祖细胞 (NPC) 的人口在 organoids。最终, 这项技术使研究人员能够迅速检测到低成本和有限设备的人脑病毒感染的机制。
在使用人脑 organoids 研究 ZIKV 感染时, 有几个注意事项需要考虑。一个重要的考虑是, 化的形成和结构是高度依赖于干细胞线, 从它们形成。在比较细胞系时要小心, 包括基因的工程线;最好的结论是使用多个 subclones, 理想的是多条干细胞系。此外, 由于这种差异的细胞线, 试点实验, 以确保适当的差异是发生在 organoids 的建议。虽然上皮结构是可见的明显微镜, 也建议进行 qRT PCR 或 cryosectioning 实验寻找神经分化标记, 如 PAX6 或磷-波形。
在同一细胞系内, 也应预测 organoids 之间的相当大的变异性。由于协议的 unpatterned 性质, 上皮结构的数量和大小在个体 organoids 之间会有所不同。通常, 你可以期望至少两个大 (> 200 µm 直径由 D24) 神经花环每化。因此, 纵向研究, 如观察化大小的变化对感染, 尤其有启发意义。批次之间的可变性也可能发生, 其中最可能的原因是不准确的细胞计数或播种。建议进行多次计数, 并确保在 ULA U 底96孔板上播种前, 细胞悬浮液混合良好。
当培养 organoids 在 ULA U 底 96-井板, 计划看到可观的蒸发作用在板材的边缘附近。这是理想的填充这些井与 PBS 和只工作与中心60井。由于蒸发, organoids 在外部井将暴露在不同的条件比那些在中心, 将可能影响他们的成长和分化。在计划需要进行实验的 organoids 的数量时, 请考虑这一点。另外, organoids 将开始满96井格式在大约30天以后, 将是可看见的由于文化媒介的变色。如果计划采取 organoids 过去的30天, 建议将 organoids 转移到一个 ULA 24-井板。要进行转移, 使用剪刀削减 P1000 小费, 使开幕式比 organoids 本身大得多, 并转移 organoids 的移。
人脑 organoids 在促进该领域对神经和疾病的认识方面具有巨大的潜力。鼓励研究人员在必要时修改该协议。例如, 你可以实施模式的因素, 以提高分化效率, 以特定的细胞类型, 使他们能够探索病毒影响的某些解剖区域。ZIKV 的神经发育效应仍未得到很好的理解, 但这种新的方法将使研究人员有一个可访问、快速和高通量的方法来调查感染机制。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢梁美芬 l. 杨和 Burri 哈佛医学院的帮助与初步传播和量化的 ZIKV。我们还要感谢纳撒尼尔 d 帕特里克的成像支持。K.E. 得到了斯坦利精神病研究中心和哈佛干细胞研究所的支持。
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |