Denne protokol beskriver en teknik, der anvendes til at modellere Zika virusinfektion i at udvikle menneskelige hjerne. Brug vildtype eller manipuleret stamcellelinjer, kan forskere bruge denne teknik til at afdække de forskellige mekanismer eller behandlinger, der kan påvirke tidlige hjernen infektion og deraf følgende microcephalus i Zika virus-inficerede embryoner.
Den nylige fremkomst af Zika virus (ZIKV) i modtagelige befolkninger har ført til en brat stigning i mikrocefali og andre neurologiske udvikling betingelser i nyfødte spædbørn. Mens myggene er den væsentligste overførselskilde viral, har det også vist at spredes via seksuel kontakt og lodret moderen til fosteret transmission. I dette sidstnævnte tilfælde af transmission, på grund af den unikke virale tropisme af ZIKV, menes virussen overvejende mål de neurale stamceller (NPC) af udvikle hjernen.
Her en metode til modellering af ZIKV infektion og den deraf følgende mikrocefali, der opstår, når menneskelige cerebral organoids udsættes for levende ZIKV er beskrevet. Organoids viser høje niveauer af virus inden for deres neurale stamfader befolkning, og udviser alvorlige celledød og mikrocefali over tid. Denne tre-dimensionelle cerebral organoid model gør det muligt for forskere at udføre arter-matchede eksperimenter for at observere og potentielt gribe ind med ZIKV infektion i at udvikle menneskelige hjerne. Modellen giver forbedret relevans over todimensional standardmetoder og indeholder menneskelige-specifikke cellulære arkitektur og protein udtryk, der ikke er muligt i dyremodeller.
Zika virus (ZIKV) har hurtigt spredt sig i Mikronesien, Fransk Polynesien og Amerika, og har for nylig vist sig at krydse placentamembranen1,2 for at inficere udvikle føtal hjernen, fører til udviklingsforstyrrelser sygdomme, sådan som mikrocefali3,4,5,6 . Den langsigtede virkning på disse patienters liv, og den nuværende mangel på behandling, har ført forskere og klinikere til kamp for en bedre forståelse af mekanismerne bag ZIKV infektion og replikering. Tidligere studier har undersøgt ZIKV infektion af in vitro- systemer i en bred vifte af fysiologisk relevante celle typer7,8,9, samt in vivo10 med immunkompetente og immunkompromitterede mus11,12,13 og ikke-menneskelige primater14,15,16. Ud over disse mere konventionelle teknikker, har flere grupper gennemført stamcelle-afledt cerebral organoids at forstå mere om ZIKV infektion i udviklingslandene menneskehjernen. Disse grupper har udnyttet menneskelig cerebral organoids for at bekræfte mikrocefali fænotype17,18, undersøge receptorer knyttet til virus posten19, undersøge fysiologiske svar til infektion20 , 21, og potentielt skærmen for drug kandidater22. Her beskrives en teknik til hurtigt producere og inficere stamcelle-afledt cerebral organoids, som vist tidligere19, at forbedre forståelsen af ZIKV infektion i udviklingslandene menneskehjernen.
Da organoids dannes fra standard pluripotente stamceller (PSC) kulturer, denne teknik giver mulighed for en række videnskabelige spørgsmål besvares om viral infektion i udviklingslandene hjernen. For eksempel, kan CRISPR teknik bruges til at ændre disse PSC linjer før organoid infektion i et hurtigere tempo end de fleste i vivo genetiske undersøgelser19. Desuden, i modsætning til i standard to-dimensionelle (2D) differentiering kulturer, organoids udviser den komplekse cellulære arkitektur, der er afgørende for corticogenesis, og nyere undersøgelser har vist, at denne arkitektur kan forstyrres ved infektion 21. Endelig, den relativt lave omkostninger til at generere organoids giver mulighed for højere overførselshastighed eksperimenter og screening i forhold til i vivo modeller. På den anden side er der nogle ulemper til udnyttelsen af organoids til at studere ZIKV. Mens organoids er langt mere biologisk relevante end 2D kulturer, er der ekstra udfordringer i vurdering af organoids på grund af deres tre-dimensionelle (3D) karakter. Billedbehandling og dissociation af organoids tendens til at inddrage mere udstyr og en større investering af ressourcer end i standard 2D kulturer. Derudover mangler organoids vaskulatur og immunologiske komponenter, der er til stede i i vivo modeller, så forskere interesseret i disse aspekter af virusinfektion rådes til at søge en alternativ protokol.
Der er en række teknikker til frembringelse af menneskelige organoids og neurospheres i kultur, og de falder typisk inden for kategorierne mønstret eller unpatterned . Mønstrede metoder gennemføre faktorer for at regulere Wnt, BMP, TGFβ og andre signaling veje for at skubbe differentiering mod specifikke lineages23. Et metoder, som beskrevet her, drage fordel af tilbøjelighed til induceret pluripotente stamceller (iPSCs) og humane embryonale stamceller (hESCs) at differentiere mod en neuroectodermal slægt af standard24. Efter ca. tre uger af differentiering består de resulterende organoids af store, biomimetiske neuroepithelial strukturer, der indeholder flere celletyper, der er observeret i den tidlige udvikling hjernen.
Teknik til at producere organoids af standard, feeder-gratis PSC kulturer, og inficere disse organoids med ZIKV præsenteres i sin helhed. For vejledning om de dyrkningsbaserede metoder til feeder-fri PSC’er, henvises til tidligere metoder publikationer25,26. Desuden anvende ensartet beløb af virus til flere forsøg, er det vigtigt at beregne MOI før tid. Dette gøres ved at gennemføre en infektion af Vero celler, efterfulgt af behandling med overlay medium og inkubering immunfarvning. Beskrivelser og metoder af denne teknik har været tidligere beskrevet19,27.
Når PSC kultur når målet sammenløbet af 50% – 70%, er cellerne derefter adskilles og samles i ultra-lav 96-brønd monteringsbeslag. Cellerne er opretholdt i 3 dage i xeno-fri stamcelle vedligeholdelse medier (SCMM) og derefter konverteres til et neurale induktion medier til resten af kulturen. Når organoids har differentieret i 3 uger, kan infektionen gennemføres. Ved rutinemæssigt at tage billeder i løbet af den uge efter infektion, vil forskere observere progressive celledød og forstyrrelse af organoid. Forskere kan også adskille organoids på denne tid til at gennemføre transcriptional eller proteom profilering. Metoderne Cryosectioning og lightsheet anbefales til billedbehandling, og forskere kan forvente at se høje niveauer af infektion og viral replikation især inden for de neurale stamceller (NPC) cellepopulationer i organoids. I sidste ende, denne teknik giver forskere hurtigt undersøge mekanismerne for viral infektion af den menneskelige hjerne med lave omkostninger og begrænset udstyr.
Der er flere forbehold at overveje, når udnytte menneskelige cerebral organoids at undersøge ZIKV infektion. En vigtig overvejelse er denne organoid dannelse og struktur er meget afhængige af stamcelle linje fra hvilket de er dannet. Vær forsigtig ved sammenligning mellem cellelinjer, herunder isogene manipuleret linjer; Det er bedst at gøre konklusioner ved hjælp af flere subclones, og ideelt set flere stamcellelinjer. Desuden på grund af denne forskel i cellelinjer, pilot forsøg for at sikre, at ordentlig differentiering sker i organoids anbefales. Mens neuroepithelial strukturer er synlige ved brightfield mikroskopi, foreslås det også for at udføre qRT-PCR eller cryosectioning eksperimenter til at lede efter neurale differentiering markører som PAX6 eller phospho-vimentin.
Man bør også forudse betydelig variation blandt organoids inden for den samme cellelinje. På grund af et karakteren af protokollen, kan antallet og størrelsen af neuroepithelial strukturer variere mellem individuelle organoids. Typisk kan man forvente mindst to store (> 200 µm i diameter af D24) neurale rosetter pr. organoid. Af denne grund er longitudinelle studier, såsom observation af ændring i organoid størrelse efter infektion, særligt oplysende. Variation mellem partier kan også forekomme, med den mest sandsynlige årsag til dette at være unøjagtige celle optælling eller såning. Det anbefales at foretage flere tæller og for at sikre cellesuspension er godt blandet før såning på ULA U-bunden 96-brønd plader.
Når dyrkning organoids i ULA U-bunden 96-brønd plader, har plan om at se betydelig fordampning effekter omkring kanterne af pladerne. Det er ideelt at udfylde disse brønde med PBS og kun arbejde med center 60 brønde. På grund af fordampning, vil organoids i de yderste brønde blive udsat for forskellige vilkår end dem i midten, som sandsynligvis vil påvirke deres vækst og differentiering. Venligst overveje dette ved planlægning af antallet organoids, der vil være behov for eksperimenter. Derudover vil organoids begynde at vokse hen over 96-brønds format efter ca 30 dage, som vil være synlig på grund af misfarvning af næringssubstratet. Hvis planer om at tage organoids forbi 30 dagene, anbefales det at overføre en organoids til en ULA 24-godt plade. At gennemføre overførslen, bruge saks til at skære en P1000 tip, så åbningen er meget større end organoids, sig selv, og overføre organoids af pipettering.
Menneskelige cerebral organoids holde stort potentiale i at fremme feltets forståelse af nervesystemets udvikling og sygdom. Forskere opfordres til at ændre protokollen som nødvendigt. For eksempel kunne man gennemføre mønstre faktorer for at forbedre differentiering effektivitet mod bestemte celletyper, får mulighed at udforske de virale virkninger på visse anatomiske områder. Neuro-udviklingsmæssige virkninger af ZIKV er stadig dårligt forstået, men denne nye tilgang vil give forskere en tilgængelig, hurtig og høj overførselshastighed måde at undersøge mekanismerne af infektion.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Priscilla L. Yang og Dominique J. Burri fra Harvard Medical School for hjælp med indledende formering og kvantificering af ZIKV. Vi vil også gerne takke Nathaniel D. Kirkpatrick understøttelse af billedbehandling. K.E. blev støttet af Stanley Center for psykiatrisk forskning og Harvard stamcelle Institute.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |