Her præsenterer vi en mikroskopi-baseret protokol for høj opløsning imaging og en tre-dimensionel rekonstruktion af musen neurovaskulære enhed og blod – hjerne barrieren ved hjælp af hjernen frit svævende sektioner. Denne metode giver mulighed for visualisering, analyse og kvantificering af intracellulære organeller på BBB.
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk flercellede interface, der regulerer transporten af molekyler mellem omsætning og hjernen. Transcytosis på tværs af BBB regulerer levering af hormoner, metabolitter og terapeutiske antistoffer til hjernen parenkym. Vi præsenterer her, en protokol, der kombinerer immunfluorescens af frit svævende sektioner med laser scanning Konfokal mikroskopi og billedanalyse til at visualisere subcellulært organeller i endothelial celler på BBB. Kombinere dette datasæt med 3D billede analyse software giver mulighed for den semi-automatiske segmentering og kvantificering med kapillar volumen og areal, samt antallet og intensiteten af intracellulære organeller på BBB. Påvisning af musen endogene immunoglobulin (IgG) i intracellulære vesikler og deres kvantificering på BBB bruges til at illustrere metoden. Denne protokol kan potentielt anvendes til undersøgelse af de mekanismer, der styrer BBB transcytosis af forskellige molekyler in vivo.
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en kontinuerlig cellulære barriere dannet af astrocytter, pericytes, neuroner og endotelceller, der adskiller det centrale nervesystem (CNS) fra blod omsætning1. Regulering af transport på tværs af BBB spiller en afgørende rolle i at opretholde hjernen homøostase og er medieret af specialiserede egenskaber i endothelial hjerneceller (BECs). Tilstedeværelsen af stramme intercellulære kryds mellem BECs og en lav basal transcytosis grænse for paracellular og transcellular transport af blodbårne molekyler, henholdsvis2. For nylig, transcytosis pathway i BECs har været udnyttes til at øge levering af terapeutiske store molekyler til hjernen3,4. Mekanismerne i transcytosis på tværs af BBB har dog endnu ikke været fuldt karakteriseret5,6.
Omfattende arbejde er blevet gjort i vitro for at dechifrere de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer intracellulær transport på tværs af BECs7,8,9,10, 11, men sådanne systemer undlader at sammenfatte de komplekse arkitektur og fysiologi af neurovaskulære enhed (NVU). På den anden side undersøgelser i vivo12,13 give detaljerede kvantitative oplysninger om transportpriser på tværs af BBB men give ikke indsigt i de intracellulære mekanismer af transport. Derfor forbliver undersøge de cellulære og intracellulære komponenter af NVU i vivo og ex vivo meget udfordrende14. Kun et begrænset antal teknikker er indstillet til at analysere subcellulært strukturer i cellerne i NVU. De fleste undersøgelser bruger elektronmikroskopi, men denne teknik er begrænset af protokollerne komplekse kræves for korrekt væv forberedelse og prøve håndtering. Derfor oprettede vi en metode baseret på høj opløsning Konfokal mikroskopi, der ville lette behandlingen af hjernen prøver, analysen og kvantificering af subcellulært rum inden for celler af NVU.
Her, beskriver vi en protokol, der udnytter mus hjernen frit svævende sektioner for at udføre kvantitative billeddannelse af BBB og NVU på cellulært og subcellulært niveau. Vi testet og godkendt en række antistoffer mod billede og rekonstruere NVU i tre dimensioner. Derudover tillader denne protokol imaging på maksimal optisk diffraktion-begrænset opløsning organeller i hjernen kapillærerne. Sammen med billedanalyse, kan denne protokol bruges til at undersøge intracellulær transport af makromolekyler på tværs af BBB under forskellige forsøgsbetingelser, f.eks i mus sygdomsmodeller af neurodegeneration.
Den protokol, der er skitseret ovenfor beskriver forberedelse af hjernen frit svævende sektioner, immunfluorescent farvning, image erhvervelse og analyseparametre for høj opløsning mikroskopi af BBB. Denne metode har været for nylig brugt til at undersøge lokalisering af antistof levering platforme3, transport af endogene IgG på tværs af BBB17og heterogenitet af BBB ved pericyte tab18. Forskellige trin i protokollen kan ændres for at tilpasse sig til de specifikke mål for eksperimentet. Første, brug af tykke (100 µm) sektioner letter håndteringen under procedurerne for immunfarvning og montering. Det giver også mulighed for 3D rekonstruktion af den kapillære netværk, neurovaskulære enhed, og generation af kapillar og NVU tværsnit. Dog penetration af antistoffer i afsnittene væv kan variere og nogle antistoffarvning kan være begrænset til de overfladiske lag af væv tæt på coverslip. Protokollen kan ændres ved at øge koncentrationen af vaskemiddel under trinnet permeabilization og/eller længden af permeabilization skridtet til at forbedre antistof penetration ind i vævet. Andet, billedkvalitet kan blive kompromitteret, når du forsøger at erhverve billeder dybere i væv (normalt 20 til 30 µm under overfladen) på grund af lysspredning samt optiske aberrationer fra brydningsindeks uoverensstemmelse. For at løse dette problem, kan nye metoder til væv clearing og aktive antistof penetration20 kombineres med denne protokol til billedet større mængder af væv. For det tredje udføres deconvolution efter billede erhvervelse at forbedre aksial opløsningen af billedet. Valget af den blinde deconvolution algoritme bruges i denne protokol var baseret på (i) sin brugervenlighed, som ingen før beregning af funktionen punkt-spredning er nødvendig, (ii) dens robusthed til at forbedre billed kvalitet21, og (iii) manglende artefakter på mIgG intracellulære strukturer efter gennemførelsen. Afhængigt af de intracellulære strukturer visualiseret i stikprøven, kan andre deconvolution algoritmer resultere i højere billedkvalitet. De følgende referencer21,22 giver en omfattende diskussion om de fordele og begrænsninger af yderligere algoritmer til billede deconvolution. Endelig tilladt at bruge et billede analyse softwarepakken segmenteringen af kapillærer og intracellulære strukturer i tre dimensioner. Klart billedanalyse er begrænset ikke til den software, der er beskrevet i protokollen og alternative pakker, for eksempel de drøftet i reference23, kan anvendes til segment billeder. Egnetheden af forskellige software-programmer til analyse af intracellulære strukturer på tværs af BBB skal verificeres empirisk ved at vurdere nøjagtigheden af billedsegmentering.
Da denne metode er baseret på faste prøver, giver det ikke direkte oplysninger om dynamikken af transcytosis på tværs af BBB. Men det kan kombineres med tidsforløb eksperimenter24, for eksempel af intravenøst indsprøjte molekyle af interesse og måle dens ophobning i BECs på forskellige tidspunkter efter injektion, at rekonstruere forsvindingskinetik intracellulær transport. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det giver mulighed for analyse af dyb brain regioner, som vist i18, der er i øjeblikket utilgængelig for intravital live imaging tilgange. Et kritisk trin i protokollen er omhyggelig overvågning af væv fiksering. Fiksering med 4% PFA dramatisk reducerer immunogenicitet af intracellulære organeller og endogene eller perifert administreret immunoglobuliner17 (figur 1B). En begrænsning af denne protokol er dens krav om høj kvalitet antistoffer (dvs., lav uspecifik farvning, lav krydsreaktivitet) egnet til immunfluorescens. Forudsat at sådanne reagenser er tilgængelige, kan metoden anvendes til at undersøge den intracellulære lokalisering af eventuelle protein af interesse. For eksempel, blev protokollen brugt til at identificere lysosomer i hjernen endotelceller17. Det skal også bemærkes, at da denne protokol er baseret på Konfokal mikroskopi, den laterale opløsning er begrænset af diffraktion og kan ikke løse strukturer mindre end ca 175-250 nm (figur 2).
Tidligere undersøgelser har udført detaljeret analyse af cellulære sammensætningen af det neurovaskulære enhed ved hjælp af konfokalmikroskopi25,26. Imidlertid bygger undersøge intracellulær transport på BBB primært på brugen af transmissions Elektron Mikroskopi19,27,28. Mens denne metode giver den højeste laterale opløsning af intracellulære strukturer, forbliver elektronmikroskopi en udfordrende teknik med lav dataoverførselshastighed. Desuden er antallet af forskellige molekylære mål, som kan visualiseres ved EM meget begrænset. Denne protokol tilbyder tilgængelige alternativ for at undersøge intracellulær transport på BBB. Den komplette procedure, fra hjernen samling til billedanalyse, kan udføres i 5-6 dage. Hvis passende antistoffer er tilgængelige, tillader immunofluorescens samtidige påvisning af flere celle typer/molekyler inden for samme prøve. Denne protokol kan desuden kombineres med super-resolution mikroskopi-teknikker til at overvinde begrænsningerne i rumlige opløsning29. Samlet set protokollen beskrevet ovenfor giver mulighed for kvantificering af ændringer i den intracellulære lokalisering af proteiner af interesse inden for den neurovaskulære enhed. Sin ansøgning om forskellige genetiske eller farmakologiske perturbationer vil give mulighed for at undersøge de intracellulære struktur og transport funktioner af BBB i vivo.
The authors have nothing to disclose.
R.V. arbejde blev støttet af en Roche postdoc stipendium (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |