Denne protokol beskriver en teknik til observation af real-time grøn fluorescens Protein (NGL) mærket glukose Transporter 4 (GLUT4) protein handel på insulin stimulation og karakterisering af CCR5 biologiske rolle i insulin – GLUT4 signalering pathway med Deconvolution mikroskopi.
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global sundhedskrise, som er karakteriseret ved insulin signalering værdiforringelse og kronisk betændelse i perifere væv. Hypothalamus i centralnervesystemet (CNS) er kontrolcenter for energi og insulin signal svar forordning. Kronisk betændelse i perifere væv og ubalancer af visse kemokiner (f.eks. CCL5, TNFα og IL-6) bidrage til diabetes og fedme. Men de funktionelle mekanismer forbinder kemokiner og hypothalamus insulin signal forordning stadig er uklare.
In vitro primære neuron kultur modeller er praktisk og enkle modeller, som kan bruges til at undersøge insulin signal forordning i hypothalamus neuroner. I denne undersøgelse indført vi exogeneous GLUT4 protein konjugeret med normal god landbrugspraksis (NGL-GLUT4) i primære hypothalamus neuroner til at spore GLUT4 membran translokation på insulin stimulation. Time-lapse billeder af normal god landbrugspraksis-GLUT4 protein handel blev indspillet af deconvolution mikroskopi, der tillod brugere at generere høj hastighed og høj opløsning billeder uden at beskadige neuronerne betydeligt mens foretage forsøget. Bidrag af CCR5 i insulin reguleret GLUT4 omplantningen blev observeret i CCR5 mangelfuld hypothalamus neuroner, der blev isoleret og kulturperler fra CCR5 knockout mus. Vores resultater viste, at GLUT4 membran translokation effektivitet blev reduceret i CCR5 mangelfuld hypothalamus neuroner efter insulin stimulation.
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) er en global sundhedskrise. T2DM er præget af insulin signalering værdiforringelse og kronisk betændelse i perifere væv. Hypothalamus er det kontrolcenter, som regulerer kroppens energi homøostase, appetit og døgnrytmen. Vigtigst, medierer hypothalamus også insulin signal lydhørhed for at regulere systemisk stofskifte1,2,3,4,5. Forstyrre hypothalamus insulin signalering pathway kunne fremkalde insulin resistens6,7. Hypothalamus koordinerer cellulære energi status og udskillelsen af hormoner, som insulin og adipokines (fx, leptin) fra de perifere væv, at regulere systemisk glukosemetabolismen, insulin lydhørhed og fødeindtagelse. Insulin binding til insulin receptor aktiveres insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som derefter aktivere insulin downstream signaling molekyler, såsom PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) og AKT (protein kinase B (PKB/AKT)), til at fremkalde GLUT4 membran translokation. Neuroner er ikke de store mål for glukoseoptagelse i svar til insulin; dog er betydelige niveauer af GLUT4 udtryk blevet identificeret i regionen hypothalamus arcuate kernen (ARC). Derfor, regulering af GLUT4 i hypothalamus neuroner kan spille en vigtig rolle i insulin signalering i hjernen-perifere akse.
Mange undersøgelser har antydet, at kronisk inflammation og inflammatoriske kemokiner i hypothalamus spiller også en vigtig rolle i udviklingen af diabetes og fedme, og hæmning af hypothalamus betændelse kan tilbageføre kost-induceret insulinresistens 8 , 9 , 10. Desuden, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, også kendt som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) og dens receptor CCR5 niveauer også hænger sammen med udviklingen af T2DM11,12. CCL5 og CCR5 roller i insulin funktion og glukose metabolismen er uklare. En undersøgelse rapporteret at CCR5 mangel beskyttet mus fra fedme-induceret inflammation, makrofag rekruttering og insulin resistens11; i modsætning, rapporterede en anden undersøgelse, at CCR5 mangel forringer systemisk glukosetolerance, samt adipocyt og muskel insulin signalering12. CCL5 er fundet at øge glukoseoptagelse i T-celler og reducere fødeindtagelse gennem sin indsats på hypothalamus13,14, men både virkningsmekanismen og de involverede receptorer er endnu at blive identificeret.
Det er vanskeligt at undersøge de cellulære mekanismer bag virkningen af perifere væv betændelse på insulin funktion i hypothalamus neuroner. Dette er på grund af cellulære heterogenitet og neuron kredsløb feedback bestemmelser. Af denne grund giver en in vitro- celle kultur model en ren model til at undersøge virkningerne af chemokine på hypothalamus insulin signal forordning. Selvom der er mange etableret udødeliggjort hypothalamus neuronal cellelinjer til forskning brug, disse cellelinjer udtrykt forskellige markører, og derfor repræsenterer forskellige typer af hypothalamus neuroner15. Selvom primære hypothalamus kulturer kan være vanskelige at vedligeholde, de kan levere de mest realistiske svar af hypothalamus neuroner ved insulin stimulation, og kan også undgå potentiale ukendte virkninger, som kommer i spil når opretholdelse af celler langsigtet dyrkningsmedium med kunstige vækstfaktorer.
Heri, vi udnytte primære hypothalamus neuroner fra både C57BL/6 vildtype (WT) musen og CCR5 knockout (CCR5– / –), og transfect begge typer af celler med normal god landbrugspraksis-GLUT4 konstruktion. For at undersøge CCR5 bidrag til insulin medieret GLUT4 membran handel, blev normal god landbrugspraksis-GLUT4 transfekteret neuroner behandlet med insulin eller rekombinante CCL5. Vi karakteriserer derefter bevægelighed for normal god landbrugspraksis-GLUT4 på plasmamembran i primære hypothalamus neuroner med Deconvolution mikroskopi.
Evnen til at overvåge levende celler, ved CCL5 eller insulin stimulation, er af afgørende betydning for at studere den hurtige virkning af CCL5 eller insulin på GLUT4 bevægelse. I virkeligheden, det giver os mulighed at visualisere den store forskel mellem WT og CCR5– / – hypothalamus neuroner ved insulin stimulation. Vi har udført den overflade mærkning af endogene GLUT4 protein i WT og CCR5– / – hypothalamus neuroner på forskellige tidspunkter efter insulin stimulation17. Mærkning af celle overflade proteiner kræver høj specificitet antistof med lav baggrund. Derudover kan overflade fluorescens kvantificering også være udfordrende og tidskrævende. Således time-lapse optagelse tillader os at være sikker på, at virkningen af CCL5 eller insulin er et sandt fysiologiske ændringer baseret på forsøgsbetingelser, snarere end en statistiske variation. Sammen med overflade mærkning af endogene GLUT4, leverer vi stærke beviser og eksperimenter for at vise, hvordan CCL5 og CCR5 deltage i GLUT4 omplantning og insulin signalering.
I moderne cellebiologi og molekylær biologi undersøgelser kræver mange eksperimenter brugen af Fluorescens mikroskopi. Denne teknologi giver forskerne til at visualisere den rumlige forhold mellem proteiner og/eller cellulære organeller, ud over bevægelsesretning og hastighed, stimulerende virkninger, morfologiske ændringer og protein handel. Denne teknologi har dog stadig sin begrænsning: når fluorophores er glade, signaler, der udsendes fra target protein (eller område) kan blive overvældet af baggrunden fluorescens. Som et resultat, kan fluorescens billeder vises sløret med forventede signaler begravet dybt ind i baggrunden signaler. Dette fænomen er særligt tydeligt for observation af membran-bundet proteiner.
Total interne Reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM) blev udviklet for at overvinde denne vanskelighed. Det giver forskerne til at visualisere excitation af valgte overflade-bundet fluorophores uden at påvirke baggrund fluorophores. Det giver forskerne at selektivt karakterisere funktioner og begivenheder på en meget tynd overflade region som et plasma membran. Deconvolution mikroskopi er en beregningskrævende billedbehandling teknik, der er gjort mulig ved hjælp af teknologiske fremskridt i de seneste år. Det er ofte blevet udnyttet for at forbedre digital fluorescens billedopløsning. Som nævnt tidligere, når fluorophores er ved at blive ophidset af nogen form for belysning (f.eks. laser eller LED), vil alle fluorophores udsende lys signaler uanset om de er i fokus eller ej, så billedet altid vises sløret. Denne sløring er forårsaget af et fænomen kaldet “Punkt spredes funktion” (PSF), som lys kommer fra et lille fluorescerende kilde (lyspunkt) bliver spredt ud yderligere og blive ude af fokus (sløring). I princippet, denne begivenhed vil producere et timeglas-lignende formet fluorescerende signal og et fluorescens billede kan gøres op i mange sådanne lys signaler. Deconvolution proces kan gentildele alle fluorescens signaler til sin oprindelige lyse plet form og fjerne det meste af out-of-fokus lys for at forbedre kontrasten i billedet.
I de seneste år, har deconvolution algoritmer genererede billeder med sammenlignelige opløsning end en Konfokal mikroskop. Desuden, i forhold til TIRFM, som forhindrer out-of-fokus sløring fra at blive opdaget af en begrænset excitation region, wide-felt mikroskopi tillader alle lys signaler til at blive opdaget og omfordeler dem tilbage til deres kilde gennem deconvolution proces. Derfor i praksis er deconvolution mikroskopi blevet en mere effektiv image erhvervelse metode, men også en mere omkostningseffektiv metode i forhold til JOHANNAS mikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for de tilskud, der er fastsat af Ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) og sundhed og velfærd tillæg af tobaksvarer – MOHW106-TDU-B-212-144001 til S-Y C.
DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
Insulin | Actrapid, Denmark | ||
Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |