Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos
Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour générer la prolifération et quiescentes fibroblastes dermiques humains primaires, surveillance des taux de décomposition de transcription et d’identifier les gènes différentiellement en décomposition.
Abstract
Quiétude est un état temporaire, réversible dans lequel les cellules ont cessé la division cellulaire, mais conservent la capacité à proliférer. Plusieurs études, y compris la nôtre, ont démontré que la quiescence est associée aux changements répandus dans l’expression des gènes. Certains de ces changements se produisent à travers des changements dans le niveau ou l’activité des facteurs associés à la prolifération de transcription E2F et MYC. Nous avons démontré que carie ARNm peut également contribuer aux changements dans l’expression des gènes entre les cellules prolifèrent et repos. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour établir les cultures de fibroblastes humains par voie cutanée prépuce proliférantes et repos. Nous décrivons ensuite les procédures permettant d’inhiber la nouvelle transcription dans des cellules proliférantes et repos avec l’actinomycine D (ActD). ActD traitement représente une approche simple et reproductible de dissociant nouvelle transcription de désintégration de la transcription. Un inconvénient du traitement ActD, c’est que le cours du temps doit être limité à un court laps de temps parce que ActD affecte la viabilité des cellules. Les niveaux de transcription sont surveillés au fil du temps afin de déterminer le taux de décroissance de transcription. Cette procédure permet l’identification des gènes et des isoformes qui présentent une carie différentielle chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.
Introduction
Niveaux de l’état stationnaire de transcriptions reflètent la contribution de synthèse de transcription et de désintégration de la transcription. Réglementé et décomposition de transcription coordonnée est un mécanisme important pour contrôler les processus biologiques1,2,3,4. Par exemple, la vitesse de décomposition transcription ont démontré à contribuer à la série temporelle des événements après l’activation par le facteur de nécrose tumorale de cytokines inflammatoires5.
Nous avons déjà montré que la transition entre la prolifération et de la quiétude dans les fibroblastes humains primaires est associée aux changements dans les niveaux de transcription de nombreux gènes6. Certains de ces changements reflètent des différences dans l’activité de facteurs de transcription entre ces deux États.
Changements dans les taux de décroissance de transcription peuvent également contribuer à des changements dans le niveau d’expression d’un transcrit dans deux États différents7,8. D’après nos constatations antérieures que la transition entre la prolifération et la quiescence est associée aux changements dans les niveaux de multiples microARN9, nous avons demandé s’il y a également une contribution de désintégration de transcription différentielle dans les changements expression des gènes chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.
Afin de contrôler la stabilité de la transcription, nous avons déterminé le taux de décomposition des transcriptions Génome-large en proliférant versus cellules quiescentes. Pour ce faire, nous avons mesuré la vitesse de décomposition en proliférant versus quiescentes fibroblastes en introduisant un inhibiteur de la nouvelle transcription et surveillance de la fréquence à laquelle des relevés de notes individuels ont disparu au fil du temps. L’avantage de cette approche est que, comparativement aux méthodes qui surveillent tout simplement l’expression des gènes globale, en inhibant la synthèse nouvelle transcription, nous serons en mesure de déterminer la vitesse de décroissance de ces transcriptions indépendamment de la vitesse à laquelle ils doivent transcription de l’acte.
ActD traitement d’inhiber la nouvelle transcription et déterminer le taux de décroissance de transcription a été appliqué avec succès dans plusieurs études antérieures. ActD a été utilisé pour disséquer l’importance de la stabilité du RNA dans les changements dans l’abondance de transcription qui résultent d’un traitement par des cytokines pro-inflammatoires,5. Une approche similaire a également servie à disséquer les différences dans les taux de décroissance de transcription en multiplient par rapport aux cellules C2C12 différenciées qu’ils adoptent un muscle différenciée phénotype10. Comme autre exemple, global mRNA demi-vies ont également été détectés dans pluripotentes et11des cellules souches embryonnaires de souris différenciées. Dans ces exemples, dégradation de l’ARNm s’est avérée être important pour réglementer l’abondance de la transcription et la transition de cellules à cellules différents États.
Appliquant les méthodes décrites ci-dessous, nous avons découvert changements dans les taux de décroissance de transcription dans environ 500 gènes lorsque l’on compare les fibroblastes prolifèrent et quiescentes États12. En particulier, nous avons découvert que les cibles des miARN miR-29, qui est diminuée dans les cellules quiescentes, sont stabilisés lorsque des cellules de transition de quiescence. Nous décrivons ici la méthodologie que nous permet de déterminer la vitesse de décomposition dans les cellules prolifèrent et repos. Cette méthode est utile pour comparer global taux de décomposition des ARNm dans deux distincts mais comparables si l’on cherche des informations sur la décomposition rapide des gènes. Il pourrait également être utilisé pour traiter d’autres questions telles que l’effet des conditions de culture cellulaire sur la décomposition de transcription, par exemple, en deux dimensions par rapport à trois dimensions cultures. La vitesse de décomposition peut être déterminée Génome-large avec des méthodes telles que les puces ou RNA-Seq. alternativement, en temps réel qPCR ou Northern blot peut être utilisé pour déterminer le taux de décomposition sur une base de gène par gène ou isoform-par-isoforme. Ces taux permet ensuite de calculer la demi-vie de chaque gène surveillé et d’identifier les gènes avec des taux de décomposition qui sont différents dans les deux conditions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quiescence peut être induite par des signaux externes, y compris le retrait des mitogènes ou le sérum, le manque d’adhésion cellulaire et l’inhibition de contact. Inhibition de contact, un des plusieurs méthodes possibles pour induire la quiescence, est un processus hautement évolutives conservé dans lequel les cellules sortie prolifératif cycle cellulaire en réponse à un contact cellule-cellule. Nous nous concentrons ici sur l’inhibition de contact à titre d’exemple d’une méthode pour induire la qu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC était le savant Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Ce travail a été financé par des dons à la HAC from the National Institute of General Medical Sciences Centre bourse d’Excellence GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 à David août, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Institut National des Sciences médicales générales R01 GM0866465, l’Eli & Edythe Broad Centre de médecine régénératrice & Stem Cell Research, NIH Health Center/UCLA ILEC féminin Iris Cantor Grant UL1TR000124 et la leucémie Lymphoma Society. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P50CA092131. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. HAC est membre de l’Eli & Edythe large Centre de médecine régénératrice & Stem Cell Research, l’Institut de biologie moléculaire de UCLA et le programme interministériel de bioinformatique de UCLA.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
Riferimenti
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
