Proliferating और Quiescent मानव Fibroblasts में जीनोम चौड़ा प्रतिलिपि क्षय दरों का निर्धारण
Summary
हम proliferating और quiescent प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblasts पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, प्रतिलिपि क्षय दर की निगरानी, और विभेदक क्षय जीन की पहचान ।
Abstract
weak एक अस्थायी, प्रतिवर्ती अवस्था है जिसमें कोशिकाएं कोशिका विभाजन की स्थिति में रहती हैं, लेकिन पैदा की क्षमता को बनाए रखती हैं । हमारे सहित कई अध्ययनों, प्रदर्शन किया है कि weak जीन अभिव्यक्ति में व्यापक परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । इनमें से कुछ परिवर्तन E2F और MYC जैसे प्रसार-संबद्ध प्रतिलेखन कारकों के स्तर या गतिविधि में परिवर्तन के माध्यम से होते हैं । हमने प्रदर्शन किया है कि mRNA क्षय भी proliferating और quiescent कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए योगदान कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम मानव चमड़े की चमड़ी fibroblasts की proliferating और quiescent संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रक्रिया का वर्णन । हम तो Actinomycin डी (ActD) के साथ proliferating और quiescent कोशिकाओं में नए प्रतिलेखन बाधा के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन । ActD उपचार प्रतिलिपि क्षय से dissociating नए प्रतिलेखन के लिए एक सीधा और प्रतिलिपि दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । ActD उपचार का एक नुकसान यह है कि समय पाठ्यक्रम एक कम समय सीमा तक सीमित किया जाना चाहिए क्योंकि ActD कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित करता है । प्रतिलिपि स्तर समय पर नजर रखी है प्रतिलिपि क्षय दर निर्धारित करते हैं । इस प्रक्रिया जीन और isoforms कि proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अंतर क्षय प्रदर्शन की पहचान के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
टेप के स्थिर राज्य स्तर दोनों प्रतिलिपि संश्लेषण और प्रतिलिपि क्षय के योगदान को प्रतिबिंबित । विनियमित और समन्वित प्रतिलिपि क्षय जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है1,2,3,4. उदाहरण के लिए, प्रतिलिपि क्षय दर भड़काऊ cytokine ट्यूमर परिगलन कारक द्वारा सक्रियण के बाद की घटनाओं के लौकिक श्रृंखला में योगदान करने के लिए दिखाया गया है5.
हम पहले से पता चला है कि प्रसार और प्राथमिक मानव fibroblasts में weak के बीच संक्रमण कई जीन6के प्रतिलिपि स्तर में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । इन परिवर्तनों में से कुछ इन दोनों राज्यों के बीच प्रतिलेखन कारकों की गतिविधि में अंतर को प्रतिबिंबित ।
एक प्रतिलिपि क्षय की दर में परिवर्तन भी दो विभिंन राज्यों में एक प्रतिलिपि के अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन के लिए योगदान कर सकते है7,8। हमारे पहले के निष्कर्षों के आधार पर है कि प्रसार और weak के बीच संक्रमण के कई microRNAs के स्तर में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है9, हमने पूछा कि क्या वहां भी परिवर्तन में अंतर प्रतिलिपि क्षय से एक योगदान है जीन proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अभिव्यक्ति.
आदेश में प्रतिलिपि स्थिरता की निगरानी के लिए, हम टेप जीनोम के क्षय की दर निर्धारित proliferating बनाम quiescent कोशिकाओं में व्यापक । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम proliferating बनाम quiescent fibroblasts में क्षय दर नए प्रतिलेखन के एक अवरोधक शुरू करने और दर जिस पर व्यक्तिगत टेप समय पर गायब हो निगरानी द्वारा मॉनिटर । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि, के रूप में तरीके कि बस समग्र जीन अभिव्यक्ति की निगरानी की तुलना में, नई प्रतिलिपि संश्लेषण बाधा से, हम इन टेप के लिए क्षय दर निर्धारित करने में सक्षम होंगे दर से अलग है जिस पर वे कर रहे है लिखित.
ActD उपचार के लिए नए प्रतिलेखन को बाधित और प्रतिलिपि क्षय दर निर्धारित सफलतापूर्वक कई पिछले अध्ययन में लागू किया गया है । ActD की प्रतिलिपि में परिवर्तन में आरएनए स्थिरता का महत्व टुकड़े के लिए इस्तेमाल किया गया है कि समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के साथ उपचार से परिणाम5. एक समान दृष्टिकोण भी proliferating बनाम विभेदित C2C12 कोशिकाओं में प्रतिलिपि क्षय दर में मतभेद टुकड़े इस्तेमाल किया गया है के रूप में वे एक विभेदित मांसपेशियों phenotype10। एक अंय उदाहरण के रूप में, ग्लोबल mRNA आधा जीवन भी pluripotent और विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं11में पाया गया है । इन उदाहरणों में, mRNA क्षय के लिए प्रलेखित बहुतायत विनियमन और कोशिकाओं के विभिंन सेल राज्यों के संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है ।
तरीकों को लागू करने के नीचे वर्णित है, हम लगभग ५०० जीन में प्रतिलिपि क्षय दर में परिवर्तन की खोज की जब proliferating और quiescent राज्यों में fibroblasts की तुलना12। विशेष रूप से, हमें पता चला कि microRNA मीर-29, जो quiescent कोशिकाओं में downregulated है के लक्ष्यों को स्थिर कर रहे है जब weak के लिए कोशिकाओं को संक्रमण । हम यहां पद्धति का वर्णन हम proliferating और quiescent कोशिकाओं में क्षय दर निर्धारित किया करते थे । यह पद्धति वैश्विक mRNA क्षय दर दो अलग लेकिन समान स्थितियों में तुलना के लिए उपयोगी है जब तेजी से क्षय जीन के बारे में जानकारी मांगी है । यह भी ऐसे प्रतिलिपि क्षय पर सेल संस्कृति की स्थिति के प्रभाव के रूप में अंय सवालों के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, दो आयामी बनाम तीन आयामी संस्कृतियों में । क्षय दर microarrays या आरएनए-Seq जैसे तरीकों के साथ जीनोम-वाइड निर्धारित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, वास्तविक समय qPCR या उत्तरी सोख्ता एक जीन द्वारा-जीन या isoform-by-isoform आधार पर क्षय दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन दरों में तो प्रत्येक मॉनिटर जीन के आधे जीवन की गणना करने के लिए और क्षय की दर है कि दो स्थितियों में अलग है के साथ जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
weak mitogens या सीरम, सेल आसंजन की कमी, और संपर्क निषेध की वापसी सहित बाहरी संकेतों से प्रेरित किया जा सकता है । संपर्क निषेध, weak उत्प्रेरण के लिए एक से अधिक संभव तरीकों में से एक, सेल के लिए सेल संपर्क के जवाब में ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC रीता एलेन फाउंडेशन (http://www.ritaallenfoundation.org) के मिल्टन ई. Cassel विद्वान थे । इस काम के लिए अनुदान से HAC को राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान केंद्र के उत्कृष्टता अनुदान P50 GM071508 (P.I. डेविड Botstein), PhRMA फाउंडेशन ग्रांट 2007RSGl9572, नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट ओसीआई-१०४७८७९ से दाऊद अगस्त, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM081686, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM0866465, द एली & #38; Edythe व्यापक केंद्र के पुनर्अपक्षय चिकित्सा & #38; स्टेम सेल अनुसंधान, आईरिस खिचड़ी भाषा महिला स्वास्थ्य केंद्र के UCLA CTSI NIH ग्रांट UL1TR000124, और ल्यूकेमिया लिंफोमा सोसायटी । इस प्रकाशन में दी गई अनुसंधान सूचना राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के पुरस्कार संख्या P50CA092131 के अंतर्गत समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । HAC का सदस्य है एली & #38; Edythe व्यापक केंद्र के पुनर्अपक्षय चिकित्सा & #38; स्टेम सेल अनुसंधान, ucla आणविक जीवविज्ञान संस्थान, और ucla Bioinformatics विभागीय कार्यक्रम ।
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
Riferimenti
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