ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。
Summary
転写減衰率を監視および差動腐食の遺伝子を識別する生成する増殖の静止プライマリひと真皮線維芽細胞、プロトコルについて述べる。
Abstract
静穏化は、細胞が細胞分裂を停止しているが、増殖する能力を保持一時的なリバーシブルの状態です。私たちを含めた複数の研究は、静穏化が遺伝子発現の広範な変化に関連付けられているを示しています。これらの変更のいくつかはレベルまたは E2F と MYC などの増殖関連転写因子の活動の変更によって発生します。Mrna が細胞増殖と静止細胞間の遺伝子発現の変化にも貢献できると私たちを示しています。このプロトコルでは人間の皮膚包皮線維芽細胞の増殖と静止の文化を確立する手順をについて説明します。我々 は、アクチノマイシン d (ActD) 増殖と静止細胞に新しい転写を阻害する手順を説明します。ActD 治療は、トラン スクリプトの崩壊から新しい転写を分離する簡単で再現性のあるアプローチを表します。ActD 治療の欠点は ActD セル実行可能性に影響を与えるので、時間経過が短い時間枠に制限しなければなりません。転写減衰率を決定するための時間をかけて議事録レベルが監視されます。この手順は、遺伝子と対静止線維芽細胞増殖の差動腐食を示すアイソ フォームの同定できます。
Introduction
成績証明書の定常状態レベルは、トラン スクリプトの合成と転写減衰の両方の貢献を反映しています。調整され、調整された転写減衰は生物学的プロセス1,2,3、4を制御するための重要なメカニズム。たとえば、転写減衰率は、炎症性サイトカインの腫瘍壊死因子5次の活性化イベントの時系列に貢献する示されています。
我々 は以前に増殖と大人しいの主な線維芽細胞間の移行は多くの遺伝子6のトラン スクリプト レベルの変更に関連付けられています。これらの変更のいくつかはこれらの 2 つの状態間の転写因子の活性の違いが反映されます。
トラン スクリプトの減衰率の変化は、2 つの異なる状態7,8の謄本の発現レベルの変化にも貢献できます。増殖と静穏化の間の遷移が複数のマイクロ Rna は9レベルの変化に関連付けられている私たちの以前の調査結果に基づいて、変化の差分コピー崩壊からの寄与があるかどうかを聞きました対静止線維芽細胞増殖遺伝子発現。
トラン スクリプトの安定性を監視するために、我々 は対静止細胞増殖におけるゲノムワイドな転写産物の減衰率を決定しました。ために、我々 は新しい転写の阻害剤を導入し、個々 の成績証明書は時間をかけて姿を消したレートを監視によって対静止線維芽細胞増殖の減衰率を監視します。このアプローチの利点は、単に新しいトラン スクリプトの合成を阻害することによって全体的な遺伝子の発現を監視する方法と比較して我々 こと彼らが率から個別にこれらの転写産物の減衰率を決定することができます。転写。
ActD 治療新しい転写を阻害し、転写減衰率を決定するのには、複数の先行研究で正常に適用されています。ActD は炎症性サイトカイン5治療に起因するトラン スクリプト豊富に変更で RNA の安定性の重要性を分析する使用されています。同様のアプローチは、差別化された筋肉表現型10を採用するときに、C2C12 細胞の分化と増殖に転写減衰率の違いを分析する使用されています。別の例としてグローバル mRNA 半減は、多能性で検出されているし、差別化されたマウス胚性幹細胞11。これらの例では mrna は、細胞の異なった細胞状態への遷移、トラン スクリプトの豊かさを調整するために重要であると示されています。
下記の方法を適用すると、我々 は、線維芽細胞増殖と静止状態12を比較するときに約 500 遺伝子転写減衰率の変化を発見しました。特に、細胞活動の静穏化に移行とダウンレギュ レート静止細胞では、マイクロ Rnaミール-29に、ターゲットは安定しているがわかりました。我々 はここで増殖と静止細胞に減衰率を決定するための手法について説明します。この方法は急速に腐食の遺伝子に関する情報が求められている時に同様の条件が異なる 2 つの世界的な mRNA 減衰率を比較するのに便利です。2 3 つの次元文化対次元にトラン スクリプト崩壊に関する培養条件の影響など他の質問に対処するも使えます。減衰率はマイクロ アレイや RNA シーケンスまたは、リアルタイム qPCR などの方法で決定されたゲノムまたは北にしみが付くことは遺伝子に遺伝子またはアイソ フォームによるアイソ フォームごとに減衰レートを決定する使用できます。これらの料金は、各監視対象遺伝子の半減期を計算して減衰率の 2 つの条件の異なる遺伝子を識別するために、使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
静穏は、mitogen や血清の撤退、細胞接着と接触抑制の欠如を含む外部信号によって誘導されうる。接触阻止、静穏化を誘導するための複数の可能な方法の 1 つは、細胞が増殖細胞周期細胞間接触の応答を終了高度進化上保存されたプロセスです。我々 はここで静穏化を誘導する方法の一例として接触阻止に注目します。以前の研究報告していること細胞細胞の接触することができますマイク?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。卓越したグラント P50 GM071508 の国立総合医学研究所センターから拍 (探偵デビッド ボットスタイン)、PhRMA の基盤助成金 2007RSGl9572、1047879 デビッド 8 月 – 国立科学財団助成 OCI に補助金によって資金が供給されたこの作品一般的な医学 R01 GM0866465、Eli の所一般医療科学 R01 GM081686 研究所 & エディス ブロード センター再生医療の & 茎細胞の研究、アイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIHグラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC、イーライのメンバーである & エディス広い再生医療センター & 幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所とカリフォルニア大学ロサンゼルス校バイオインフォマティクス部門間プログラム。
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
Riferimenti
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