Bfu genomet hele transkripsjon forfall i voksende og Quiescent menneskelig fibroblaster
Summary
Vi beskriver en protokoll for genererer voksende og quiescent primære menneskelig dermal fibroblaster, overvåking transkripsjon forfall priser og identifisere ulikt råtnende gener.
Abstract
Gågaten er en midlertidig, reversibel tilstand der cellene har opphørt celledeling, men beholde evnen til å spre seg. Flere studier, inkludert vår, har vist at gågaten er forbundet med omfattende endringer i genuttrykk. Noen av disse endringene skje gjennom endringer i nivå eller aktivitet av spredning-assosiert transkripsjonsfaktorer, som E2F og MYC. Vi har vist at mRNA forfall kan også bidra til endringer i genuttrykk mellom voksende og quiescent celler. I denne protokollen beskriver vi fremgangsmåten for å etablere voksende og quiescent kulturer av menneskelig dermal foreskin fibroblaster. Vi beskriver prosedyrene for å hemme nye transkripsjon i voksende og quiescent celler med Actinomycin D (ActD). ActD behandling representerer en grei og reproduserbar tilnærming til dissociating nye transkripsjon fra transkripsjon forfall. En ulempe for ActD behandling er at time course skal begrenses til kort tid fordi ActD påvirker celle levedyktighet. Transkripsjon nivåer overvåkes over tid å bestemme transkripsjon forfall priser. Denne prosedyren gir mulighet for identifisering av gener og isoformene som viser differensial forfall i voksende versus quiescent fibroblaster.
Introduction
Steady state nivåer av transkripsjoner gjenspeiler bidrag av både transkripsjon syntese og transkripsjon forfall. Regulert og koordinert transkripsjon forfallet er en viktig mekanisme for å kontrollere biologiske prosesser1,2,3,4. For eksempel har transkripsjon forfall priser blitt vist å bidra til den timelige rekken hendelser etter aktivering av inflammatoriske cytokin tumor nekrose faktor5.
Vi har tidligere vist at overgangen mellom spredning og gågaten i primære menneskelig fibroblaster er forbundet med endringer i transkripsjon nivåer av mange gener6. Noen av disse endringene gjenspeiler forskjeller i aktiviteten til transkripsjonsfaktorer mellom disse to landene.
Endringer i en transkripsjon forfallet rate kan også bidra til endringer i hvilket uttrykk med en utskrift i to forskjellige stater7,8. Basert på våre tidligere funn at overgangen mellom spredning og gågaten er knyttet til endringer i nivået av flere microRNAs9, spurte vi om det er også et bidrag fra differensial transkripsjon forfall i endringene i genuttrykk i voksende versus quiescent fibroblaster.
For å overvåke transkripsjon stabilitet, bestemt vi frekvensen av forfallet av transkripsjoner genomet hele i voksende versus quiescent celler. For å oppnå dette, overvåket vi forfall priser i voksende versus quiescent fibroblaster ved å innføre en inhibitor av nye transkripsjon og overvåking frekvens som individuelle transkripsjoner forsvant over tid. Fordelen med denne tilnærmingen er at i forhold til metoder som bare overvåke samlede genuttrykk, begrenser ny transkripsjon syntese, vil vi kunne bestemme forfallet rate for disse transkripsjonene separat fra sats som de er transkribert.
ActD behandling for å hemme nye transkripsjon og bestemme transkripsjon forfall priser har vært anvendt i flere tidligere studier. ActD er brukt til å analysere betydningen av RNA stabilitet i endringene i transkripsjon overflod som følge av behandling med pro-inflammatoriske cytokiner5. En lignende tilnærming er også brukt til å analysere forskjellene i transkripsjon forfallet rate i voksende versus differensierte C2C12 celler som de vedta en differensiert muskel fenotypen10. Eksempel global mRNA halv-liv har også blitt oppdaget i pluripotent og differensiert mus embryonale stamceller11. I disse eksemplene har mRNA decay vist seg å være viktig for å regulere transkripsjon overflod og for overgangen til cellene til ulike celle stater.
Bruke metodene som er beskrevet nedenfor, oppdaget vi endringer i transkripsjon forfall priser i ca 500 gener når sammenlignende fibroblaster i voksende og quiescent stater12. Spesielt oppdaget vi at målene for den microRNA miR-29, som er downregulated i quiescent celler, er stabilisert når celler overgang til gågaten. Her beskriver vi metodene vi pleide å bestemme forfall priser i voksende og quiescent celler. Denne metoden er nyttig for å sammenligne globale mRNA forfall priser i to forskjellige men lignende forhold når informasjonen om raskt råtnende gener er søkt. Det kan også brukes til å ta andre spørsmål som effekt av celle kultur på transkripsjon forfall, for eksempel i to dimensjonale versus tre dimensjonale kulturer. Forfall priser kan være bestemt genomet-wide med metoder som microarrays eller RNA-Seq. eventuelt sanntid qPCR eller nordlige blotting kan brukes til å bestemme forfall priser på gene-av-genet eller isoformen av isoformen basis. Disse prisene kan deretter brukes til å beregne halveringstiden av hver overvåkede genet og identifisere gener med forfall priser som er forskjellige i to betingelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gågaten kan indusert ved ekstern signaler inkludert tilbaketrekking av mitogens eller serum, mangel på celleadhesjon og kontakt hemming. Kontakt hemming, én av flere mulige metoder for å indusere gågaten, er en svært evolusjonært bevarte prosess der celler avslutte proliferativ celle syklusen svar til celle til celle kontakt. Vi fokuserer her på kontakt hemming som et eksempel på en metode for å indusere gågaten. Tidligere studier har rapportert at celle-celle kontakt kan påvirke microRNA biogenesis<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC var Milton E. Cassel forskeren Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd til HAC av National Institute of General Medical Sciences Excellence grant P50 GM071508 (pi David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 til David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of generelle medisinske basalfag R01 GM0866465, Eli & Edythe bred Center for regenerativ medisin & stamcelleforskning, Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, og leukemi Lymphoma Society. Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute av National Institutes of Health under prisen nummer P50CA092131. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. HAC er medlem av den & Edythe bred Center for regenerativ medisin & stamcelleforskning, UCLA Molecular Biology Institutt og UCLA bioinformatikk interdepartemental programmet.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
Riferimenti
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
