Fastställande av Genome-wide avskrift Decay priser i prolifererande och Quiescent mänskliga fibroblaster
Summary
Vi beskriver ett protokoll för generering frodas och quiescent primära mänskliga dermal fibroblaster, övervakning avskrift decay priser, och att identifiera differentially ruttnande gener.
Abstract
Rofylld är en tillfällig, reversibel stat där cellerna har upphört celldelning, men behålla förmågan att föröka. Flera studier, däribland vår, har visat att rofylld är associerade med omfattande förändringar i genuttryck. Några av dessa förändringar uppstå genom förändringar i nivån eller aktiviteten för spridning-associerade transkriptionsfaktorer, såsom E2F och MYC. Vi har visat att mRNA förfall kan också bidra till förändringar i genuttryck mellan prolifererande och quiescent celler. I detta protokoll beskriver vi förfarandet för att inrätta prolifererande och quiescent kulturer av mänskliga dermal förhud fibroblaster. Sedan beskriver vi förfarandena för att hämma nya transkription i prolifererande och quiescent celler med Actinomycin D (ActD). ActD behandling representerar en okomplicerad och reproducerbar metod att separera nya transkription från avskrift förfall. En nackdel med ActD behandling är att tid kursen måste begränsas till en kort tid eftersom ActD påverkar cellernas viabilitet. Avskrift nivåer övervakas över tid att bestämma avskrift decay priser. Detta förfarande möjliggör identifiering av gener och isoformer som uppvisar differentiell förfall i frodas kontra quiescent fibroblaster.
Introduction
Steady-state nivåerna av avskrifter återspeglar både avskrift syntes och avskrift decay bidrag. Reglerad och samordnad avskrift förfall är en viktig mekanism för kontroll av biologiska processer1,2,3,4. Avskrift decay priser har exempelvis visat att bidra till den tidsmässiga serien händelser efter aktivering av inflammatorisk cytokin tumörnekrosfaktor5.
Vi har tidigare visat att övergången mellan spridning och rofylld i primära mänskliga fibroblaster är förknippad med förändringar i avskrift nivåerna av många gener6. Några av dessa förändringar återspeglar skillnader i aktiviteten av transkriptionsfaktorer mellan dessa två stater.
Förändringar i en avskrift decay rate kan också bidra till förändringar i uttrycket av en utskrift i två olika stater7,8. Baserat på våra tidigare resultat att övergången mellan spridning och rofylld är förknippad med förändringar i nivåerna av flera mikroRNA9, frågade vi om det också finns ett bidrag från differentiell avskrift decay förändringar i genuttryck i frodas kontra quiescent fibroblaster.
För att övervaka avskrift stabilitet, fastställt vi graden av förfalla av avskrifter genome-wide i frodas kontra quiescent celler. För att uppnå detta, övervakas vi decay priser i frodas kontra quiescent fibroblaster genom att införa en hämmare av nya transkription och övervakning andelen som enskilda avskrifter försvunnit med tiden. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att vi kommer att kunna fastställa vilken förfall för dessa avskrifter separat från den kurs som de är jämfört med metoder som enkelt övervakar övergripande genuttryck, genom att hämma ny avskrift syntes, transkriberas.
ActD behandling för att hämma nya transkription och fastställa avskrift förfall har tillämpats framgångsrikt i flera tidigare studier. ActD har använts för att analysera betydelsen av RNA stabilitet i förändringar i avskrift överflöd som följd av behandling med pro-inflammatoriska cytokiner5. Ett liknande tillvägagångssätt har också använts till analysera skillnaderna i avskrift decay rate i frodas kontra differentierade C2C12 celler som de antar en differentierad muskel fenotyp10. Ett annat exempel globala mRNA halveringstider har också upptäckts i pluripotenta och differentierade mus embryonala stamceller11. I dessa exempel har mRNA förfall visat sig vara viktigt för att reglera avskrift överflöd och för övergången av celler till annan cell staterna.
Tillämpa de metoder som beskrivs nedan, upptäckte vi förändringar i avskrift decay priser i ungefär 500 gener när man jämför fibroblaster i prolifererande och quiescent staterna12. I synnerhet upptäckte vi att målen av mikroRNA miR-29, som är nedreglerade i quiescent celler, stabiliseras när celler övergången till rofylld. Här beskriver vi den metod vi använde för att fastställa förfall i prolifererande och quiescent celler. Denna metod är användbar för att jämföra globala mRNA decay priser i två olika men liknande förhållanden när information om snabbt ruttnande gener söks. Det kunde också användas för att behandla andra frågor såsom effekten av cell kultur villkor för avskrift förfall, exempelvis i två dimensioner kontra tre dimensionell kulturer. Decay priser kan vara beslutsam genome-wide med metoder såsom microarrays eller RNA-följande punkter alternativt, realtids qPCR eller Northern blotting kan användas för att fastställa förfall på basis av gen-av-gen eller isoform-av-isoform. Dessa priser kan sedan användas för att beräkna halveringstiden för varje övervakade gen och identifiera gener med förfall priser som skiljer sig i två villkor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rofylld kan induceras av externa signaler inklusive uttag mitogena substanser eller serum, avsaknad av celladhesion och kontakt hämning. Kontakt-hämning, en av flera möjliga metoder för att inducera rofylld, är en starkt evolutionärt bevarade process där celler avsluta proliferativ cellcykeln svar på cell-till-cell kontakt. Vi fokuserar här på kontakt hämning som ett exempel på en metod att inducera rofylld. Tidigare studier har rapporterat att cell-cell kontakt kan påverka mikroRNA biogenes<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC var Milton E. Cassel lärd av Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Detta arbete finansierades genom bidrag till HAC från National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grants P50 GM071508 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 till David augusti, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of allmänna medicinska vetenskaper R01 GM0866465, Eli & Edythe bred centrum för regenerativ medicin & stamcellsforskning, Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124 och leukemi lymfom samhället. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. HAC är medlem av Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & stamcellsforskning, UCLA molekylärbiologi Institutet och UCLA bioinformatik enhetsövergripande programmet.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
Riferimenti
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
