Assay ontwikkeling voor hoge inhoud kwantificering van Sod1 Mutant eiwit statistische vorming in levende cellen
Summary
Beschrijven we een methode om te kwantificeren van de samenvoeging van misfolded eiwitten. Onze gegevens-protocol lentivirale geïnduceerde stabiele cel lijn generatie, geautomatiseerde confocal beeldvorming en beeldanalyse van eiwit-aggregaten. Als een illustratieve toepassing onderzocht we het effect van kleine molecules biij SOD1 aggregatie op een tijd – en dosis-afhankelijke manier.
Abstract
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is een fatale neurodegeneratieve ziekte die kan worden veroorzaakt door erfelijke mutaties in het gen coderen koper-zink superoxide dismutase 1 (SOD1). De structurele instabiliteit van SOD1 en de opsporing van SOD1-positieve inclusies in familiale-ALS patiënten ondersteunt een mogelijke oorzakelijke rol weggelegd voor misfolded en/of geaggregeerde SOD1 ALS pathologie. In deze studie beschrijven we de ontwikkeling van een cel-gebaseerde test ontworpen te kwantificeren van de dynamiek van SOD1 aggregatie in levende cellen door hoog gehalte screening benaderingen. Met behulp van lentivirale vectoren, wij stabiele cellijnen uiting van wild-type en mutant A4V SOD1 gelabeld met gele fluorescerende eiwit en vond dat beide eiwitten werden uitgedrukt in het cytosol zonder enig teken van aggregatie gegenereerd. Interessant, alleen SOD1 A4V stabiel uitgedrukt in HEK-293, maar niet in U2OS of SH-SY5Y cellijnen, gevormd aggregaten op proteasoom remmer behandeling. We laten zien dat het mogelijk is te kwantificeren van de samenvoeging op basis van de dosis / respons-analyse van diverse proteasoom-remmers, en voor het bijhouden van aggregaat-vorming kinetiek door time-lapse microscopie. Onze benadering introduceert de mogelijkheid van kwantificering van het effect van de mutaties ALS over de rol van SOD1 in statistische vorming, alsmede het screenen voor kleine moleculen waardoor SOD1 A4V aggregatie.
Introduction
Aggregatie van eiwitten is een biologisch proces waarbij eiwitten groep misfolded omhoog en kan fungeren als oorzakelijke agens in neurodegeneratieve ziekten (amyloidose). Karakterisering van de aggregatie van eiwitten is essentieel in het begrip van de rol van aggregaten in cellulaire disfunctie zo goed zoals het vergemakkelijken van de ontdekking van nieuwe factoren die invloed hebben op het ontstaan van de pathologie. De visualisatie van fluorescentie-gelabelde proteïnen in levende cellen is een krachtige methode die kan helpen bij de ontwikkeling van tests op hoog gehalte screening (HCS)1,,2,,3,4van toepassing.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) wordt beschouwd als een ziekte van de proteopathic veroorzaakt door de aanwezigheid van misfolded eiwitten met de neiging om statistische en zich ophopen in de motorische neuronen in familiale ALS (fALS) zowel de sporadische ALS (sALS)5,6 . Een subset van ~ 20% van de gevallen van de fALS worden geassocieerd met dominante mutaties in het gen codering het cytosolische anti-oxidant enzym koper-zink superoxide dismutase type 1 (SOD1)7,8. Verschillende mogelijke oorzaken voor dit genetisch afgeleide dysfunctie zijn voorgesteld, met inbegrip van wijzigingen in de structuur en functie van SOD1 varianten, zoals de afwijkende stabiliteit, toegenomen ontvouwen tarief en neiging tot statistische9, 10. Met name de enige gecontroleerde en potentieel toxische eigenschap gedeeld door beide ALS alternerende SOD1-varianten en wild-type (WT) SOD1 is een verhoogde neiging tot het vormen van de verzuilde eiwit-aggregaten of eiwithoudende insluitsels11,12 . Misfolded mutant SOD1, is aanhoudend polyubiquitinated en afgebroken door het ubiquitin-proteasoom-systeem. Dientengevolge, leidt een laag niveau van remming van het proteasoom activiteit tot de opeenstapeling van mutant die sod113,14 aggregaten, welke vorm amorf structuren bestaat uit oplosbare onderdelen die kunnen worden uitgewisseld met oplosbare mutant SOD1 in het cytosol15. In bepaalde, SOD1 mutant A4V (alanine op codon 4 gewijzigd in valine) is de meest voorkomende ALS-veroorzakende mutatie, en leidt tot snelle neurodegeneratie met een gemiddelde overlevingstijd van minder dan 2 jaar na ziekte begin16. Biochemically, heeft SOD1-A4V een verhoogde neiging tot monomerize, statistische en vormen van amyloïde pores; de porie-achtige aggregaten zijn vergelijkbaar met amyloïde poriën van andere ziekte-linked mutant vormen, zoals synuclein-α en β-amyloid proteïne17. Studeren de dynamiek van SOD1-aggregaat accumulatie, blijven de methoden voor de controle van oplosbare en onoplosbare SOD1 statistische formulieren worden ontwikkeld.
Wij hebben eerder getoond, met behulp van live-cel imaging en HEK-293 cellen transfected Transient met TL proteïne-gelabeld SOD1, dat ALS-geassocieerde mutaties SOD1 dimerisatie en aggregatie11schaden. Hoewel Transiënte expressiesystemen nuttige informatie over de biologische uitkomst van kortlopende overexpressie van het gen bieden kunnen, is er wellicht methoden leveren stabiele integratie van gewenste genen voor test ontwikkeling de voorkeur. Als zodanig, bieden lentivirale vectoren de mogelijkheid om op lange termijn en gereglementeerde genexpressie op zoogdiercellen 18verlenen. In deze studie, richtten we ons op de generatie van stabiele cellijnen getransduceerde met recombinant lentivirus, rekening houdend met WT en mutant SOD1 gemarkeerd met gele fluorescerende eiwit (YFP). Met behulp van live-cel imaging microscopie en geautomatiseerde kwantificering van SOD1 aggregatie, wij geactiveerd en gekwantificeerd SOD1 aggregatie gebeurtenissen op remming van het proteasoom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee belangrijkste benaderingen voor het genereren van stabiele cellijnen. De eerste duurt enkele weken en voorbijgaande transfectie en weerstand selectie van de genomic geïntegreerde plasmide DNA vectoren vereist. De tweede is een kwestie van uren door het gebruik van lentivirus, maken van dit protocol vatbaar voor de effectieve uitdrukking van doel eiwit in meerdere cellijnen met beperkte inspanning. De reis-CMV vector19 was een aanhoudende vector te gebruiken, met geconserveerde transd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) en het nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) individuele wetenschapper support program (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Riferimenti
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
