Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme
Summary
Biz toplama misfolded proteinlerin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim protocol detayları lentiviral istikrarlı hücre satırı üretimi, otomatik confocal görüntüleme ve görüntü analizi protein toplamları indüklenen. Açıklayıcı bir uygulama olarak SOD1 toplama bir saat ve doz bağımlı şekilde teşvik küçük moleküller etkisini okudu.
Abstract
Amyotrofik lateral skleroz (ALS) gen kodlama bakır-çinko süperoksit dismutaz 1 (SOD1) devralınan mutasyonlar neden ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. SOD1 yapısal istikrarsızlık ve ailesel ALS hastalarında SOD1 pozitif kapanımlar tespiti ALS patoloji misfolded ve/veya toplanan SOD1 için potansiyel bir nedensel rolü destekler. Bu çalışmada, canlı hücreler toplamada SOD1 dinamikleri ölçmek için yaklaşımlar eleme yüksek içerik tarafından tasarlanmış bir hücre tabanlı tahlil gelişimini açıklar. Lentiviral vektörler kullanarak, biz vahşi tipi ve mutant A4V sarı floresan protein ile öğesini ve her iki proteinler sitozol toplama belirtisi olmadan ifade edildi bulundu SOD1 ifade istikrarlı hücre satırları oluşturulur. İlginçtir, sadece SOD1 A4V stabil HEK-293 ile ifade ancak U2OS veya SH-SY5Y hücre hatlarında proteasome inhibitörü tedavisi üzerine toplamları biçimi değil. Çeşitli proteasome inhibitörleri doz-yanıt analize göre toplama ölçmek ve toplama-oluşumu Kinetik tarafından hızlandırılmış mikroskobu izlemek mümkün olduğunu göstereceğiz. Yaklaşımımız ALS mutasyonlar rolünü SOD1 toplama oluşumunda etkisi miktarının yanı sıra SOD1 A4V toplama önlemek küçük moleküller için tarama olanağı sunar.
Introduction
Protein toplama biyolojik bir işlem tarafından hangi kadar proteinler grup misfolded ve nörodejeneratif hastalıklarda (Amiloidoz) etken ajanı olarak hareket edebilir olur. Protein toplama karakterize patoloji başlangıcı etkileyen yeni faktörler keşfi kolaylaştırılması olduğu gibi hücresel disfonksiyon de toplamları rolünün anlaşılması önemlidir. Floresans öğesini proteinler canlı hücreler arasında görselleştirme deneyleri (HCS)1,2,3,4eleme yüksek içeriğe uygun geliştirilmesine yardımcı olabilir güçlü bir yöntemdir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS) toplamak ve ailesel ALS (fALS) ve sporadik ALS (sALS)5,6 motor nöronlarda birikir eğilimi ile misfolded proteinlerin kaynaklanan bir proteopathic hastalık olarak kabul edilir . Bir alt fALS olguların % 20 ~ ilişkili baskın mutasyonlar gen sitozolik antioksidan enzim kodlama ile bakır-çinko süperoksit dismutaz yazın 1 (SOD1)7,8. Bu genetik olarak türetilmiş disfonksiyon için birkaç olası nedeni, yapısı ve SOD1 türevleri, anormal istikrar, artmış unfolding hızı ve toplam9eğilimi gibi fonksiyon değişiklikleri de dahil olmak üzere önerilmiştir, 10. Özellikle tek doğrulanmış ve potansiyel olarak toksik özelliği her iki SOD1 ALS bağlantılı türevleri tarafından paylaşılan ve vahşi-tipi (WT) SOD1 bölümlere protein toplamları veya proteinaceous kapanımlar11,12 oluşturmak için artan bir eğilimi olduğunu . Misfolded mutant SOD1, ısrarla polyubiquitinated olduğunu ve ubiquitin-proteasome sistemi tarafından bozulmuş. Proteasome aktivitesinin inhibisyonu düşük düzeyde SOD113,14hangi formu amorf çözünür mutant SOD1 ile alışverişi yapabilirsiniz çözünür bileşenler yapılarından, agrega mutant birikimi sonucu olarak, yol açar sitozol15‘ te. Özellikle, SOD1 mutant A4V içinde (alanin kodon 4, Valin için değişti) en yaygın ALS neden mutasyon ve hızlı ateş hastalığı başlangıcı16sonra daha az 2 yıllık bir ortalama yaşam süresi ile yol açar. Biyokimyasal olarak, SOD1 A4V monomerize, toplamak ve amiloid gözenekleri oluşturmak için artan bir eğilim vardır; onun gözenek benzeri toplamları diğer hastalık bağlı mutant gibi form α-synuclein ve β-amiloid protein17amiloid gözeneklerin benzer. SOD1-agrega birikim dinamiklerini incelemek için geliştirilecek çözünür ve çözünmez SOD1 toplama formları izlemek için yöntem kalır.
Biz daha önce canlı hücre Imaging’i kullanma göstermiştir ve HEK-293 hücreleri geçici ALS ilişkili mutasyonlar SOD1 dimerization ve toplama11zarar floresan protein etiketli SOD1 ile transfected. Her ne kadar geçici ifade sistemleri kısa vadeli gen overexpression biyolojik sonucu hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir, istenen genlerin istikrarlı entegrasyon sağlayan yöntemleri tahlil geliştirme için tercih edilebilir. Bu nedenle, lentiviral vektörler uzun vadeli ve düzenlenmiş gen ekspresyonu memeli hücreleri 18tarihinde bir görüşme olanağı sunuyoruz. Bu çalışmada rekombinant lentivirus WT taşıyan transduced istikrarlı hücre hatları nesil üzerinde duruldu ve mutant SOD1 sarı floresan protein (YFP) ile Etiketlenmiş. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu ve SOD1 toplama otomatik miktar kullanarak, biz tetiklenir ve SOD1 toplama olayları üzerine proteasome inhibisyonu sayılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İstikrarlı hücre hatları oluşturmak için iki temel yaklaşım vardır. İlk birkaç hafta sürer ve genomik entegre plazmid DNA vektörel çizimler geçici transfection ve direnç işaretlenmesini gerektirir. İkinci birkaç saat kullanımı ile lentivirus, sınırlı bir çaba ile birden çok hücre hatlarında bu protokolü mükellef etkili ifade hedef protein yapma alır. GEZİ-CMV vektör19 , korunmuş iletim verimliliği ve istikrarlı transgene ifade ile kullanmak için sürekli bir ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Kore hükümeti (MSIP) (NMK-2014K1A4A7A01074642) ve Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) bireysel bilim adamı destek programı (NMK-2013M3A9B5076486/NMG-2015R1D1A1A09057239) tarafından finanse edilen bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Riferimenti
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
