Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発
Summary
誤って折りたたまれたタンパク質の凝集を定量化する手法について述べる.レンチ ウイルスのプロトコルの詳細は、安定的な細胞ラインの生成、自動の共焦点レーザー顕微鏡、タンパク質凝集体の画像解析に誘導されます。説明アプリケーションとして SOD1 集計時間と用量依存的に促進する上で小さな分子の影響を検討しました。
Abstract
筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は、遺伝子符号化銅亜鉛スーパーオキシドのディスムターゼ 1 (SOD1) で受継がれた突然変異によって引き起こされることができます致命的な神経変性疾患です。SOD1 構造の不安定性および家族性 ALS 患者に SOD1 正介在物の検出は、ALS の病理変性および/または集計 SOD1 の潜在的な因果的役割をサポートしています。本研究では細胞内 SOD1 集合のダイナミクスを定量化する高いコンテンツのスクリーニングのアプローチによって設計された細胞ベースのアッセイの開発について述べる.レンチ ウイルスのベクトルを使用して、我々 は野生型と変異型の A4V SOD1 黄色い蛍光蛋白質を付けられ、両方のタンパク質が細胞質凝集の兆候なしで表現された発見を表現する安定したセルラインを生成されます。興味深いことに、SOD1 A4V だけは安定、HEK 293 で表現がない U2OS または SH SY5Y 細胞におけるプロテアソーム阻害剤投与時に集計を形成します。各種のプロテアソーム阻害剤の用量反応解析に基づく集計を定量化するタイムラプス顕微鏡による集合体形成過程を追跡することが可能であるを示す.我々 のアプローチは、SOD1 A4V 塊り形成を防止する小分子のスクリーニングし同様、形成 SOD1 の役割に ALS 変異の影響の定量化の可能性を紹介します。
Introduction
蛋白質の集合であり、生物学的プロセス ミスフォールド蛋白質グループを (アミロイドーシス) の神経変性疾患の原因となるエージェントとして機能するかもしれない。蛋白質の集合を特徴づける細胞機能障害の病態の発症に影響する新しい要因の発見を促進するように同様の骨材の役割を理解することに不可欠です。細胞内のタンパク質の蛍光タグの可視化は、スクリーニング (HCS)1,2,3,4高の内容に適用される試金の開発に役立つ可能性があります強力な手法です。
筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は集計および家族性 ALS (fALS) および散発的 ALS (Sal)5,6 の運動ニューロンに蓄積する傾向の誤って折りたたまれたタンパク質の存在によって引き起こされる proteopathic 疾患とみなされる.FALS の場合の 20% のサブセットが関連付けられているゾル性細胞質の抗酸化酵素遺伝子に支配的な遺伝子変異を有する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1)7,8」と入力します。この遺伝的派生機能不全のいくつかの潜在的な原因が提案されている, 構造と機能の異常な安定性、展開数の増加、および集計9、性向などの SOD1 バリエーションの変更など 10。特に、両方の ALS リンク SOD1 の変形によって共有プロパティのみが検証し、潜在的に有害と野生型 (WT) SOD1 は仕切られたタンパク質凝集体やタンパク質の介在物11,12 を形成する増加傾向.誤って折りたたまれた突然変異体 SOD1、永続的 polyubiquitinated、ユビキチン-プロテアソーム系により劣化します。その結果、プロテアソーム活性の阻害の低レベルが突然変異体 SOD1 集計13,14, 可溶性変異 SOD1 と交換することができます水溶性の成分から成る非晶質構造を形成するの蓄積につながる細胞質15。特に、SOD1 突然変異体 A4V (アラニン コドン 4 におけるバリンに変更) は、最も一般的な ALS の原因となる突然変異と病気発症16後 2 年未満の平均生存時間と急速な神経変性に 。生化学、SOD1 A4V が monomerize、集計、およびアミロイドの毛穴を形成する傾向が増すその孔のような集計他病気にリンクされた突然変異体の形態の α-シヌクレインと β-アミロイド蛋白質17などアミロイド毛穴に似ています。SOD1 集計蓄積のダイナミクスを研究するには、水溶性と不溶性 SOD1 集計フォームを監視する方法は開発されるままです。
我々 は以前に、住セルイメージ投射を使用して、HEK 293 細胞一過性発現蛍光タンパク質タグ SOD1、ALS 関連変異体が SOD1 の活性化と集計11を損ないます。一過性発現システムは、短期的な遺伝子発現の生物学的結果について有用な情報を提供できますが、目的の遺伝子の強固な統合を提供するメソッドがアッセイ開発に適して可能性があります。そのため、レンチウイルスベクターは哺乳類セル18長期的かつ調整された遺伝子の発現を付与する能力を提供しています。本研究では WT を軸受組換えレンチ ウイルスで導入した安定したセルラインの生成に着目した、変異 SOD1 が付いた黄色い蛍光蛋白質 (YFP)。生細胞イメージング顕微鏡と SOD1 集計の自動定量評価を使用して、我々 はトリガーされ、プロテアソームの阻害に SOD1 集約イベントを定量化します。
Protocol
Representative Results
Discussion
安定したセルラインを生成するための 2 つの主な方法があります。最初の数週間を要するし、ゲノムの統合されたプラスミド DNA ベクターの一時的なトランスフェクションと抵抗の選択が必要です。2 番目は、限られた努力で複数の細胞株における標的タンパク質の効果的な表現に従うこのプロトコルを作る、レンチを使用して時間の問題を受け取ります。保存された伝達効率と安定した遺伝…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、韓国政府 (MSIP) (NRF 2014K1A4A7A01074642)、および国立研究財団の韓国 (NRF) 個々 の科学者サポート プログラム (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) によって資金を供給された助成金によって支えられました。
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
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