Сверхэкспрессия и очищение человека<em> Cis</em> -пренилтрансфераза в<em> Escherichia coli</em
Summary
Простой протокол для сверхэкспрессии и очистки оптимизированной кодоном, цис- пренилтрансферазы человека, в неденатурирующих условиях, от Escherichia Coli , а также анализ ферментативной активности. Этот протокол может быть обобщен для производства других цис- prenyltransferase белков в количестве и качестве пригодных для механистических исследований.
Abstract
Пренилтрансферазы (ПТ) представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) посредством многочисленных реакций конденсации. DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- PT (образующий цис- двойные связи из реакции конденсации), который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP). DHDDS имеет биомедицинское значение, поскольку неконсервативная мутация (K42E) в ферменте приводит к пигментной ретиниту , что в конечном итоге приводит к слепоте. Поэтому настоящий протокол был разработан для получения большого количества очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований. Здесь использовалось использование белкового синтеза, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в <eм> E. Коли. Описанный протокол прост, экономичен и экономит время. Гомология цис- ПТ среди разных видов предполагает, что этот протокол может быть применен и для других эукариотических цис- ПТ, таких как те, которые участвуют в синтезе натурального каучука.
Introduction
Пренилтрансферазы представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) с помощью многочисленных реакций конденсации 1 , 2 . Ферменты Z-типа катализируют образование цис- двойных связей из реакции конденсации, тогда как ферменты E-типа катализируют образование транс- двойной связи 3 . Цис- Пренилтрансферазы ( цис- PT, ферменты Z-типа) классифицируются классически по их длине цепи продукта в короткоцепочечные (C 15 ), среднецепочечные (C 50-55 ) и длинноцепочечные (C 70-120 ) 4 . DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- ПТ, который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP) 1, 5 , 6 . Это приводит к образованию дегидродолихилдифосфата, полифенилдифосфата C 55-100, служащего в качестве предшественника доличилпирофосфата, молекулы гликозильного носителя, участвующей в N-связанном гликозилировании белка 1 . Среди ашкеназских евреев миссенс-неконсервативная мутация (K42E) в DHDDS приводит к пигментной аутосомно-рецессивной ретинитации 7 , 8 . Поэтому настоящий протокол был разработан для получения очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований.
Escherichia coli считается наиболее удобным и экономически эффективным хозяином для экспрессии рекомбинантного белка и, следовательно, также является наиболее часто используемым хозяином. Однако, когда вы пытаетесь гетерологично сверхэкспрессировать белки в E.coli , необходимо учитывать специфичные для белка соображения. Получение правильно сложенных, активныхE рекомбинантных белков из E.coli , не является простым делом из-за различий в свойствах различных белков. Для преодоления этих препятствий были разработаны многочисленные подходы. Здесь использовалось использование белка, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в E. coli . Следует отметить, что предыдущая попытка сверхэкспрессировать дрожжи cis- PT без слияния белка оказалась неудачной из-за полной нерастворимости даже в присутствии детергента 12 . Описанный протокол прост, экономичен, экономит время и позволяет получать препараты DHDDS, подходящие для механистических исследований. Учитывая гомологию цис- ПТ среди разных видов, мы предлагаем, чтобы этот протокол можно было применять и для других эукариотических цис- ПТ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь для очистки функциональных человеческих DHDDS в клетках E. coli, прост и эффективен, что позволяет сверхэкспрессировать и очищать белок через 3-4 дня после того, как имеется подходящая конструкция. Такие протоколы для очистки белка имеют особое значение, учитыв…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Центром научно-исследовательского совершенства Израиля (I-CORE) в области структурной клеточной биологии (1775/12), а Научный фонд Израиля предоставил 1721/16 и 2338/16 (YH) и 825/14 (DK ). Поддержка Фонда Fields Estate DK высоко ценится. Эта работа была выполнена Иланом Эдри и Михалом Голденбергом в частичном выполнении требований МД на медицинском факультете Саклера Тель-Авивского университета.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Riferimenti
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
