정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드
Summary
제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.
Abstract
교양된 설치류 두뇌 분할은 신경 및 그들의 정상적인 vivo에서 상호 작용의 대부분을 유지 하는 환경에서 명과의 세포질이 고 분자 행동을 공부 하 고 유용 합니다. 다양 한 유전자 변형 마우스 라인 또는 붙일 태그가 단백질 또는 야생 타입 두뇌 조각에서 기자 들의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터의 사용에서 얻은 조각 고해상도 이미징 형광 현미경 검사 법에 의해 허용. 비록 뇌 조각, 조각 문화를 결합 하 여 수행 하는 기능을 영상에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다 오래 기간 동안 라이브 분할 영역에 특정 셀의 반복적인 고해상도 이미징 문제 행 세 하고있다. 이것은 최고의 사용자를 보호 하 고 교차 오염을 방지 하는 닫힌된 시스템에서 수행 하는 이후 외 인 단백질의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터 사용 하는 경우 이것은 특히 사실. 간단한 수정 롤러 튜브 뇌 조각 문화 방법에 많은 주 동안 조각의 반복 고해상도 이미징 동봉된 시스템에서 허용 하는 보고 됩니다. 경작 photoetched coverslips에서 조각 신속 하 고 정확 하 게 다른 치료 전후 시간이 지남에 동일한 필드를 이미지를 무대 위치를 표준 마크의 사용을 허용 합니다. 예 특정 신경 얼룩 및 hippocampal 조각 건축에서 변화를 관찰 하는 식, 형광 단백질의 바이러스 중재 신경 식 및 cofilin 병리학의 개발이이 방법의 사용에 대 한 표시 됩니다. 이전 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드의 올리고 슬라이스 치료 응답에 Alzheimer의 질병 (광고)의 해 마에서 관찰 되었다.
Introduction
해리 신경 설치류 두뇌의 지역에서의 기본 문화 연구자에 의해 병 적 응답을 관찰 하는 데 사용 하는 중요 한 도구 연루 자극 이다. 그러나, 이러한 연구 결과 뉴런만 2d에서 고 glial 지원 시스템 없이 보는 단점이 있다. 또한, 그것에 매우 높은 밀도 (640 뉴런/m m2 또는 표면적의 약 16%)의 조건 하에서 성장 하지 않는 한 불가능 하다 hippocampal 세포 몸, 짧은 거리 보다 더 모 수석 또는 축 삭의 무작위 결과 따라 신경 생존 4 주 이상1을 제한 연령 관련 pathologies의 확장된 연구에 대 한 천연된 문화를 사용 하 여 크게 떨어진다. 쥐 두뇌에서 준비 하는 조각의 경작 주 또는 몇 개월에 대 한 조직된 세포 건축과 생존 능력을 유지 하 여 이러한 한계를 극복 하는 매력적인 옵션 이다. 조각 문화에 설치류 두뇌의 많은 다른 영역을 유지 하기 위한 조건 설명된2되었습니다.
두 가지 주요 방법을 뇌 조각의 장기적인 문화 위해 널리 이용 된다: 공기-액체 인터페이스3 막에 경작 또는 밀봉 된 튜브에 coverslips에 경작 폭4를 제공 하는 롤러 인큐베이터에서 회전 수. 세포 막에 경작 하는 조각 직 립 현미경과 물 집중 목표5를 사용 하 여 고해상도 형광 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 또는, 조각 세포 막에 교양 있다 유리 하단 요리는 거꾸로 한 현미경6을 사용 하 여 모 수석 등뼈의 좋은 해상도 달성 하기 위해 양도 되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 세포 막에 성장 조각 이미징의 중간 변화를 필요로 하 고 자주를 방지 하거나 줄이기 위해 오염5,6antifungal 항생제 사용할 오픈 시스템 있습니다. 공기-매체 인터페이스에서 막에 조각 우수한 형태 및 생존, 유지 하지만 실험만 작은 셀 그룹에 다음과 같은 하지 않으면 높은 확대에 반복적인 이미징 동안 정확한 위치에 반환 하는 것은 매우 어려운 형광 성 감 적 표현. 세포 막에 성장 조각 transgenes5,6의 바이러스 중재 식이 사용 되었습니다, 비록 biosafety 프로토콜 동봉된 문화 시스템에 사용 되는 특정 바이러스 성 벡터에 대 한 고용 수 필요할 수 있습니다. 단백질 및 세포 생리학의 기자 태그 붙일 표현. 또한, 침수 목표 문화5에 따라 샘플 사이 오염 제거를 해야 합니다. 막 인터페이스 문화의 주요 응용 프로그램 시간 포인트7에서 생리학과 고해상도 이미징을 결합 이다.
플라스틱 튜브 안에 coverslips와 롤러 튜브 메서드는 coverslip 제거 하지 않고 어떤 전기 생리학 또는 고해상도 이미징 허용 하지 않습니다. 따라서,이 메서드는 장기 연구는 후 고정 관찰 한8에 가장 자주 적용 되었다. 여기에 설명 된 롤러 튜브 문화 기술을 활용 하지만 만큼 문화에 대 한 반복적으로 몇 군데 수 coverslips에 조각으로 교 련된 아웃 튜브에 유지 되는 방법이입니다. 동봉 된 시스템 이미징에 대 한 중간 변화를 요구 하 고 높은 확대, 일 또는 주 후에 정확한 필드 이전 몇 군데 이미징 수 있도록 하는 표준 마크를 제공 하는 photoetched coverslips를 활용 하 여.
우리 쥐 해 마 메모리 및 학습에 관련 된 주요 뇌 영역에에서 변화를 검사 하려면이 메서드를 적용 합니다. 쥐 해 마 종종 병 적인 또는 연령과 관련 된 변화 인지 장애9, 광고에서 발생 하는 개발 하는 동안 관찰 모델으로 공부 된다. 우리의 방법은 AD8의 특징은 Aβ 펩 티 드, 증가 등 환경 변화에 대 한 응답에서 시간이 지남에 단일 슬라이스 내에서 개발 하는 병리학 변화를 공부 하는 특히 적합 합니다. 한 병리학 인간과 설치류 광고 뇌와 관련 된 cofilin 걸의 존재 이며 봉, 필 라 멘 트 cofilin와 말라의 후자 포함 번들은 1:1 어 금 니 비율10,11, 12. 봉 고정 조각 cofilin GFP hypoxia8, 대상이 표현 라이브 설치류 뇌 조각 내에서 뿐만 아니라 쥐 해 마 Aβ 치료 따르는의 관찰 되었습니다 그리고 그들은 광고에서 본 시 냅 스 기능 장애에 기여할 수 그리고 선입니다. 여기 우리는 시간 코스와 다른 바이러스에 의해 도입 된 표현된 exogenous 공상 형광 단백질의 조각 내에서 분산을 관찰 하는 것이 새로운 자란 메서드를 사용 합니다. 우리는 다음 cofilin 막대 및 수용 성 Aβ 올리고 (Aβo)와 치료에 대 한 응답에서 hippocampal 조각에 집계 병리학의 발전에 따라 cofilin 기자 구문의 신경 특정 식을 이용 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 롤러 튜브 메서드 장기 배양 및 슬라이스 뇌 조직의 고해상도 라이브 이미징에 대 한 수 있습니다. 장착 및 유지 보수의 조각에 슬라이스 기법으로 여기 적용 한 주요 문제가입니다. Coverslip 코팅 슬라이스 접착을 지 원하는 홍보 조각 조각;에서 셀의 마이그레이션 및 neurites의 파생물을 강화 하 여 숱이 따라서, 우리는이 기판의 사용을 피 했다. 3-aminopropyltriethoxysilane와 함께 처리 하 …
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
Riferimenti
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
