Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado
Summary
Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.
Abstract
Fatias de cérebro de roedor cultivadas são úteis para estudar o comportamento de neurônios e glia em um ambiente que mantém muitas das suas interações normais na vivo celular e molecular. Fatias obtidas a partir de uma variedade de linhas de rato geneticamente modificado ou o uso de vetores virais para expressão de proteínas fluorescente etiquetadas ou repórteres em fatias de cérebro de tipo selvagem permitem imagens de alta resolução por microscopia de fluorescência. Embora vários métodos têm sido desenvolvidos para imagem fatias do cérebro, combinando cultura fatia com a capacidade de realizar imagens de alta resolução repetitiva de células específicas em fatias ao vivo durante longos períodos de tempo tem colocado problemas. Isto é especialmente verdadeiro quando os vetores virais são utilizados para a expressão de proteínas exógenas desde que isto é feito melhor em um sistema fechado para proteger os usuários e evitar a contaminação cruzada. Simples modificações feitas ao método de cultura rolo tubo cérebro fatia que permitem imagens de alta resolução repetitiva de fatias durante muitas semanas em um sistema fechado são relatadas. Cultivo de fatias em photoetched lamelas permite o uso de marcas fiduciais rapidamente e precisamente reposicionar o palco para o campo idêntico de imagem ao longo do tempo, antes e depois de tratamentos diferentes. Exemplos são mostrados para o uso desse método combinado com coloração neuronal específica e expressão para observar alterações em fatias hippocampal arquitetura, expressão neuronal mediada por viral de proteínas fluorescentes e o desenvolvimento de patologia cofilin, que anteriormente foi observada no hipocampo de doença de Alzheimer (AD) em resposta ao tratamento da fatia com oligômeros de peptídeo de amiloide-β (Aβ).
Introduction
Cultura primária de neurônios dissociadas de regiões do cérebro de roedor é uma importante ferramenta usada por pesquisadores para observar respostas para patologicamente implicado estímulos. No entanto, tais estudos têm a desvantagem de olhar para os neurônios em 2D única e sem seu sistema de apoio a glia. Além disso, a não ser crescidas sob condições de muito alta densidade (640 neurônios/mm2 ou cerca de 16% da superfície), no qual ele torna-se impossível acompanhar a consequência aleatória de um dendrito ou axônio para mais do que uma curta distância do corpo celular, hipocampo viabilidade neuronal durante 4 semanas diminui significativamente1, limitando o uso de culturas dissociadas de estendido estudos das patologias relacionadas com a idade. O cultivo de fatias preparadas a partir de cérebro de roedor é uma opção atraente que supera essas limitações, mantendo uma arquitetura organizada cell e viabilidade para semanas ou meses. As condições para a manutenção de muitas regiões diferentes do cérebro de roedor em fatia cultura foram descritos2.
Dois métodos principais são amplamente utilizados para a cultura a longo prazo de fatias de cérebro: cultivo nas membranas para a interface ar-líquido3 ou cultivo em lamelas em tubos fechados pode para girar em uma incubadora de rolo para fornecer aeração4. Fatias cultivadas nas membranas podem ser fotografadas diretamente com microscopia de fluorescência de alta resolução usando um microscópio vertical e de objectivos de imersão de água5. Alternativamente, fatias cultivadas nas membranas foram transferidas para pratos de fundo de vidro para obter uma boa resolução de espinhas dendríticas, usando um microscópio invertido6. No entanto, ambos os métodos de imagem fatias crescidas nas membranas são sistemas abertos que exigem mudanças de médio e costumam usam antifúngico e/ou antibióticos para evitar ou reduzir a contaminação5,6. Fatias de uma membrana na interface ar-médio mantêm excelente morfologia e sobrevivência, mas retornando para locais precisos durante repetitivo imaging na alta magnificação é extremamente difícil, a menos que a experiência está seguindo apenas pequenos grupos de células expressando um marcador fluorescente. Embora fatias cultivadas em membranas têm sido utilizadas com expressão viral mediada de transgenes5,6, protocolos de biossegurança podem exigir um sistema fechado de cultura ser empregado por certos vetores virais que são usados para expressando fluorescente etiquetado proteínas e repórteres da fisiologia celular. Além disso, objectivos de imersão exigem descontaminação entre amostras que será seguido em cultura5. Uma aplicação importante das culturas de interface da membrana é a combinação de imagem de alta resolução com eletrofisiologia em tempo único pontos7.
Método do tubo do rolo com lamelas dentro do tubo plástico não permite qualquer eletrofisiologia ou imagens de alta resolução sem remover a lamela. Assim, este método foi aplicado mais frequentemente para estudos de longo prazo em que a pós-fixação observações tenham sido feitas a8. Descrito aqui é um método que utiliza a técnica de cultura de tubo do rolo, mas nos tubos perfurados-out com fatias em lamelas que podem ser fotografadas repetidamente para contanto que as culturas é mantido. O sistema fechado não requer nenhuma mudança média para a imagem latente e utiliza as lamelas de photoetched para fornecer marcas fiduciais que permitem que a imagem em alta ampliação, após dias ou semanas, os campos precisos previamente fotografados.
Nós aplicamos esse método para examinar alterações em roedor hipocampo, uma região do cérebro importantes envolvido na aprendizagem e memória. O hipocampo de roedor frequentemente é estudado como um modelo para alterações patológicas ou relacionadas com a idade observada durante o desenvolvimento do impairment cognitive9, tais como aqueles que ocorrem no anúncio. Nosso método é particularmente adequado para estudar as alterações patológicas que se desenvolvem dentro de uma única fatia ao longo do tempo em resposta às mudanças ambientais, tais como aumentos de peptídeos Aβ, que é característica da AD8. Uma patologia associada com cérebro de AD de humanos e roedor é a presença de agregados de cofilin-actina e hastes, os último contendo feixes de filamentos no qual cofilin e actina são em um 1:1 relação molar10,11, 12. as hastes têm sido observadas em fixas fatias de hipocampo de ratos após o tratamento de Aβ, bem como dentro de uma fatia do cérebro de roedores vivos expressando GFP-cofilin submetida a hipóxia8, e eles podem contribuir para a disfunção sináptica vista em AD e acidente vascular cerebral. Aqui nós usamos este novo método de cultivo para observar a evolução temporal e distribuição dentro de fatias de exógenas quiméricoes fluorescentes proteínas expressas introduzidas por diferentes vírus. Então, nós utilizamos a expressão neuronal específica de uma construção de repórter de cofilin para acompanhar o desenvolvimento da haste cofilin e patologia agregada em fatias hippocampal em resposta ao tratamento com oligômeros Aβ solúveis (Aβó).
Protocol
Representative Results
Discussion
Método do tubo do rolo aqui descrito permite cultivo a longo prazo e de alta resolução de imagem ao vivo do tecido cerebral em fatias. Um grande problema com a técnica de fatia como aplicado aqui é na montagem e manutenção de fatias. Revestimentos de lamela que oferecem suporte a adesão de fatia, promover fatia desbaste, aumentando a consequência natural de neuritos e migração de células fora da fatia; assim, evitamos o uso destes substratos. A inserção de grupos aminoácidos para o vidro por tratamento com…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
Riferimenti
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