Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Summary

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Abstract

Als gevolg van zijn geweldige hulpmiddelen voor moleculaire genetische studies is Arabidopsis thaliana een van de meest prominente model soort plantenbiologie en, vooral, reproductieve biologie van de plant. Echter, plant morfologische, anatomische en ultrastructurele analyses traditioneel betrekken tijdrovende insluiten en segmenteren van de procedures voor heldere veld, scannen en elektronenmicroscopie. Recente vooruitgang in confocale fluorescentie microscopie, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopische analyses en de continue verfijning van moleculaire technieken om te worden gebruikt op minimaal verwerkte geheel-mount monsters, heeft geleid tot een toegenomen vraag naar de ontwikkeling van efficiënte en minimal steekproef verwerkingstechnieken. In dit protocol, beschrijven we technieken voor goed ontrafeling van Arabidopsis bloemen en siliques, fundamentele technieken, clearing en sommige kleuring procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Introduction

Bloemen zijn een van de belangrijkste organen van bedektzadigen definiëren. Bloeiende planten ongeveer 90-130 miljoen jaar geleden verscheen¹, en gediversifieerde zo snel dat hun snelle verschijning werd beschreven als een “verschrikkelijke verborgenheid” door Charles Darwin². De belangen van plant onderzoekers in Bloemontwikkeling zijn divers. Wat onderzoek heeft zich gericht op het begrijpen van de evolutionaire oorsprong van de bloem als geheel, of de ontwikkeling van specifieke anatomische, structurele en functionele eigenschappen van bloemen^3,4,5,6 . De hoge variatie in floral vorm en structuur, evenals de vervoermiddelen seksuele en ongeslachtelijke voortplanting beroep op hen, maken de bloem een zeer complexe structuur. Dit heeft geleid tot diverse inspanningen te karakteriseren van de anatomie en de structurele kenmerken van floral organen, met behulp van licht en elektron microscopische technieken die kunnen worden gecombineerd met genetische en moleculaire onderzoeken⁷. Bovendien, als de bron van vruchten en zaden, zijn bloemen van het allergrootste belang voor de voeding van mens en dier. Dus, de karakterisatie van bloem en fruit ontwikkeling heeft veel gevolgen voor toegepast onderzoek, met inbegrip van de veiligstelling van de voedselvoorziening voor een toenemende menselijke bevolking en de strategieën van de ecologische behoud onder een veranderende omgeving^{8 , 9 , 10}.

Bloemontwikkeling Arabidopsis begint met bloem inductie en de transformatie van de vegetatieve meristeem aan een meristeem bloeiwijze (groep van bloemen). Bloem primordia zijn lateraal gestart op de flank van de bloeiwijze meristeem¹¹. De bloemen orgel primordia vormen geleidelijk in concentrische slierten van buiten naar het midden van de bloem, en zich uiteindelijk ontwikkelen tot kelkbladen, bloemblaadjes, meeldraden en carpellen⁷. Deze bloemen organen vervullen verschillende voedend, beschermende en functionele (bijvoorbeeldpollinator attractie) rollen in verschillende plantensoorten, met het ondersteunen van de ontwikkeling van mannelijke en vrouwelijke gametofyten, respectievelijk¹² geslachtsorganen ^{, 13}. de gametofyten, op zijn beurt, elk onderscheiden een paar van mannelijke (sperma) en vrouwelijke gameten (ei en centrale cel), die verenigen op dubbele bevruchting tot het vormen van de volgende generatie, de zygote en de primaire endosperm, een terminal weefsel, ter ondersteuning van de ontwikkeling van het embryo^14,15. Vruchten en zaden ontwikkeling steunen de groei, rijping en bewaring van het embryo en, uiteindelijk, de versnippering. Uitgebreid onderzoek heeft verricht om het karakteriseren van bloem en embryo-ontwikkeling in diverse plantensoorten, vooral in de model soorten Arabidopsis^7,16,17.

Vroege microscopische analyses van de bloemontwikkeling waren gebaseerd op tijdrovende monster verwerking en observatie technieken, zoals paraffine of hars inbedding en segmenteren, in combinatie met licht of elektronenmicroscopie. Deze traditionele microscopische technieken werden vaak gebruikt in combinatie met moleculaire genetische onderzoeken, zoals microscopische analyses van mutanten, de lokalisatie van RNA door in situ hybridisatie, of de immuno-detectie van eiwitten. Recente vooruitgang in breed-gebied en confocal fluorescentie microscopie, in de state-of-the-art 3-D computer-aided beeld analyses, en de continue verfijning van moleculaire methoden die kunnen worden gebruikt op minimaal verwerkte geheel-mount monsters, heeft geleid tot een behoefte aan efficiënte en minimal steekproef verwerkingstechnieken die bij voorkeur zich lenen voor kwantitatieve analyses. In de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van clearing technieken op geheel-mount dierlijke exemplaar. Zij maken het monster transparant door gebruik te maken van waterige ureum of suiker gebaseerde reagentia (bijvoorbeeld, schaal, SeeDB, CUBIC)^18,19,20, of door het selectief verwijderen van lipiden (met het detergent SDS) na monsters te Embedding in stabiele hydrogels; de verwijdering van lipiden kan worden bereikt door passieve diffusie (b.v.gewijzigd duidelijkheid protocol²¹, PACT-PARS-velgen²²) of actief door elektroforese (oorspronkelijke duidelijkheid protocol²³ en ACT-PRESTO-²⁴). Aangemoedigd door deze snelle vooruitgang, enkele afgeleide technieken zijn ook in opkomst voor gebruik in planten.

In deze paper methoden gericht op het model Arabidopsis, beschrijven we de procedure voor de juiste dissectie van de bloemknoppen, bloemen, en jonge siliques en het opruimen van geheel-mount monsters voor uiteenlopende kleuring en observatie procedures met klassieke of een recente SDS gebaseerde clearing methode. Voorbeelden voor zetmeel, callose en chromatine kleuring worden gegeven. Hoewel deze procedures verdere wellicht verbeteringen en aanpassingen bij gebruik in combinatie met andere soorten, we hopen dat ze zal het decor voor verder onderzoek op deze eenvoudige maar kritische methoden die het startpunt van vele onderzoeksprojecten.

Protocol

1. bloem en Hauw fixatie Oogst bloemen en siliques uit planten gesynchroniseerd bij de opening van de eerste bloem.Opmerking: Onder de experimentele omstandigheden hier gebruikt, starten planten bloeien ongeveer 21 dagen na de transplantatie van Murashige en Skoog (MS) platen voor de bodem. Zaden zijn gelaagde voor 3-4 dagen bij 4 ° C en ontkiemd/geteeld op MS platen bij 22 ° C/16 h licht en 18 ° C/8 uur donker voor 8 tot 10 dagen, vóór het transplanteren van de zaailingen op voedselrijke bodem in pott…

Representative Results

Arabidopsis behoort tot de familie van Brassicacea, rekening houdend met bloeiwijzen met biseksuele bloemen gerangschikt in een corymb (Figuur 1). Elke bloem heeft vier kelkbladen, vier bloemblaadjes, zes meeldraden (vier lange en twee korte) en een syncarpous vruchtbeginsel bestaande uit twee congenitaal gesmolten carpellen (figuur 1F-H) gerangschikt in vier concentrische slierten25</s…

Discussion

Het bestaan van vele bloemknoppen binnen een enkele bloeiwijze van Arabidopsis, verspreid over alle ontwikkelingsstadia van de bloem, biedt een unieke gelegenheid voor studies gericht op de karakterisering van een effect van een behandeling of een ontwikkelingstoxiciteit functie gelijktijdig in de verschillende stadia van Bloemontwikkeling. Een goede referentiepunt tussen verschillende individuele planten is de opening van de eerste bloem van de belangrijkste bloeiwijze. Planten worden behandeld op een zodanige …

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.