High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione
Summary
Qui descriviamo una tecnica che combina la mutagenesi transposon con sequenziamento ad alta produttività per identificare e quantificare il trasposone leptospirale mutanti in tessuti dopo una sfida di criceti. Questo protocollo può essere utilizzato per mutanti di schermo per la sopravvivenza e la diffusione negli animali e può essere applicato anche agli studi in vitro .
Abstract
In questo manoscritto, descriviamo un trasposone sequenziamento (Tn-Seq) tecnica per identificare e quantificare i mutanti di Leptospira interrogans alterati in palestra durante l’infezione di criceti dorati siriani. TN-Seq combina mutagenesi casuale trasposone con la potenza della tecnologia di sequenziamento ad alta velocità. Gli animali sono sfidati con un pool di mutanti trasposone (ingresso piscina), seguito dalla raccolta del sangue e nei tessuti un paio di giorni più tardi per identificare e quantificare il numero di mutanti in ogni organo (uscita piscine). Le piscine di uscita vengono confrontate con la piscina ingresso per valutare l’idoneità in vivo di ogni mutante. Questo approccio consente la proiezione di una grande piscina di mutanti in un numero limitato di animali. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere eseguito con qualsiasi modello animale di leptospirosi, modelli di host di serbatoio come i ratti e i modelli di infezione acuta quali criceti, come pure gli studi in vitro . TN-Seq fornisce un potente strumento per schermo per mutanti con difetti di fitness in vivo e in vitro .
Introduction
Identificazione di geni di virulenza per alcuni batteri, come ad esempio Leptospira spp., è difficile a causa del numero limitato di strumenti genetici disponibili. Un approccio comunemente utilizzato è la creazione di una collezione di mutanti di mutagenesi casuale trasposone seguita mediante l’identificazione del sito di inserimento in ogni mutante e virulenza prova di mutanti singoli trasposone in un modello animale. Questo approccio è che richiede tempo, costoso e richiede un gran numero di animali.
Quando mutagenesi casuale è stata sviluppata per l’agente patogeno Leptospira interrogans, sono stati identificati geni coinvolti nella virulenza di test singoli mutanti in un modello animale1. Mutanti sono stati selezionati in base a criteri quali i loro ruoli potenziali nella segnalazione o motilità o loro membrana esterna prevista o posizione superficiale. Come la maggior parte dei lipopolosaccaridi geni codificano proteine ipotetiche di funzione sconosciuta2, selezione di mutanti basato su questi limiti di criteri la possibilità di scoprire i geni di virulenza leptospirale romanzo.
Più recentemente, piscine di mutanti di L. interrogans trasposoni sono state schermate per infettività nei modelli criceto e mouse3. Ogni animale è stato sfidato con un pool di fino a 10 mutanti. Infettività di un mutante è stato segnato come positivo se è stato rilevato dalla PCR di colture ottenute da sangue e reni. Prova di PCR era laboriosa perché richiedeva una reazione di PCR individuale per ogni mutante in piscina. Perché la frequenza di ogni mutante nelle culture non è stata quantificata, l’approccio era prevenuto verso identificazione di mutanti altamente attenuati.
Descriviamo un trasposone sequenziamento (Tn-Seq) tecnica, come strategia per schermo in modo più efficiente per i geni di virulenza. TN-seq è costituito dalla creazione di una libreria di mutanti mediante mutagenesi transposon seguita da sequenziamento massivo parallelo4,5,6. Brevemente, trasposoni mutanti sono riuniti, inoculati in animali e poi recuperati da diversi organi (uscita piscine). Il DNA dalle piscine uscita è estratta e digerito con enzimi di restrizione o Tosato di sonicazione. Vengono eseguiti due cicli di PCR targeting per le giunzioni dei siti inserimento trasposoni. Questo passaggio consente di aggiungere gli adattatori necessari per il sequenziamento. I prodotti PCR ottenuti sono analizzati dall’ordinamento ad alta produttività per identificare il sito di inserzione del trasposone di ogni mutante della piscina insieme a loro abbondanza relativa, che è rispetto alla composizione iniziale della piscina del mutante.
Il vantaggio principale di questo approccio è la capacità di schermo simultaneamente un gran numero di mutanti con un numero limitato di animali. TN-Seq non richiede la conoscenza dei siti inserimento trasposone che aumenta le possibilità di scoprire nuove Leptospira-geni specifici coinvolti nella virulenza con meno tempo e una maggiore efficienza. Perché leptospirale onere nei tessuti è relativamente alto in roditore modelli suscettibili di letale infezione (tipicamente 104 -108 batteri/g di tessuto)7,8,9 pure come padroni di casa serbatoio 10,11, tessuti possono essere analizzati direttamente senza la necessità di cultura, riducendo le distorsioni a causa della crescita in vitro .
Negli studi di Tn-Seq con maggior parte dei batteri patogeni descritti fin qui, l’alta frequenza di mutagenesi inserzionale ammessi infezione con grandi vasche contenenti mutanti collettivamente avendo più inserimenti trasposone ravvicinate all’interno di ogni gene4 ,12,13,14. TN-Seq è stato sviluppato anche per un batterio per cui la frequenza di mutagenesi è molto inferiore6. Con Leptospira, una libreria di mutanti trasposone può essere generata introducendo il trasposone su un plasmide che possono essere mobilitato da coniugazione come descritto da Slamti et al.15. Tuttavia, la frequenza di mutagenesi transposon di L. interrogans è bassa. Quando il trasposone Himar1 è stato introdotto su un plasmide coniugativi, la frequenza di transconjugant è stata segnalata per essere solo 8,5 x 10-8 per ogni destinatario delle cellule con il ceppo di Lai di L. interrogans16 e rischia di essere allo stesso modo scarsa con la maggior parte altri ceppi di L. interrogans. Il protocollo descritto qui è in parte basato su quello sviluppato per Borrelia burgdorferi, in cui la frequenza di mutagenesi inserzionale trasposone è anche basso6.
Per il nostro esperimento pilota con il protocollo17, abbiamo condotto la mutagenesi transposon con L. interrogans serovar Manilae ceppo L495 a causa del successo di altri gruppi ad isolare mutanti di inserimento trasposone nel ceppo insieme al suo basso LD50 (dose letale) per virulenza1. Abbiamo proiettato 42 mutanti di Tn-Seq e identificato parecchi candidati mutanti difettosi nella virulenza, compreso due con inserimenti in un gene di adenilato ciclasi del candidato. Prova individuale dei due mutanti in criceti ha confermato che erano carenti in virulenza17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se il nostro esperimento pilota per criceto sfidato intraperitonealmente con 42 L. interrogans mutanti i risultati sono presentati17, ci aspettiamo che piscine più grandi di mutanti possono essere schermate da Tn-segg. Perché la frequenza di transconjugants è bassa (100-200 transconjugants/accoppiamento), parecchi accoppiamenti sono necessari per generare un numero sufficiente di mutanti per grandi esperimenti di Tn-Seq. Mantenere un gran numero di mutanti in colture liquide pres…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un premio di merito di affari di veterani (a D.A.H.) e un istituto superiore di sanità concede R01 AI 034431 (per D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
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