باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية
Summary
الهجرة الخلية أمر ضروري لتطوير وصيانة الأنسجة وإصلاح، توموريجينيسيس، ويخضع لعوامل النمو والمستقطبات السيتوكينات. ويصف هذا البروتوكول المقايسة دوت، مقايسة هجرة ثنائية الأبعاد، وغير المقيد لتقييم النمط الظاهري المهاجرة من أوراق خلية المرفقة، متماسك استجابة لمنبهات ميكرونفيرونمينتال.
Abstract
على الرغم من أن الكائنات الحية معقدة تبدو ثابتة، أنسجتها تحت دوران مستمر. كما خلايا العمر، يموت، وهي الاستعاضة عن خلايا جديدة، الخلايا تتحرك داخل الأنسجة بطريقة مدبرة محكم. أثناء تطوير الورم، تشعر بالانزعاج هذا التوازن، وترك ورم خلايا ظهارة المنشأ لغزو المكروية المحلية، بالسفر إلى مواقع بعيدة، وتشكل في نهاية المطاف الأورام المنتشر في مواقع بعيدة. المقايسة دوت مقايسة هجرة غير مقيدة بسيطة، ثنائي الأبعاد، لتقييم صافي حركة أوراق الخلية إلى منطقة خالية من الخلية، وتحليل معلمات الهجرة الخلية باستخدام التصوير بمرور الزمن. وهنا يتضح المقايسة دوت استخدام الإنسان الغازية، ومستعمرة الرئة تشكيل خط خلية سرطان الثدي، MCF10CA1a، لتحليل استجابة للخلايا المهاجرة لعامل نمو البشرة (لو)، الذي يعرف بزيادة إمكانات خبيث لخلايا سرطان الثدي و لتغيير النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا.
Introduction
فحوصات الهجرة تستخدم على نطاق واسع لتقييم الإمكانات الغازية والمنتشر لورم الخلايا في المختبر. الأكثر شيوعاً، يستخدم بالجرح أو المقايسة الصفر لتقييم هجرة أوراق الظهارية في خلية بمسح منطقة1،2،3. لإجراء فحص الصفر، يتم مطلي الخلايا إلى أحادي الطبقة و “الصفر” أو منطقة خالية من خلية تم إنشاؤه باستخدام تلميح ماصة. مقايسة الصفر من السهل إعداد مع الإمدادات المتاحة عادة زراعة الأنسجة، ويمكن أن يؤديها في لوحات متعددة جيدا، مما يسمح لتجهيز عينات متعددة. ومع ذلك، كما هو الصفر، الخلايا يتم إزالتها فعلياً من أحادي الطبقة وغالباً الخضوع لموت الخلايا. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تلف المصفوفة خارج الخلية التي تعلق على اللوحة خلال عملية الخدش. وبالمثل، إدراج استخدام السليكون (مثل الدوائر عبدي4) أو من الاستنسل5،،من67 يمكن أن يؤدي إلى اضطراب الميكانيكي للخلايا وإزالة جزئية من البروتينات المصفوفة تستخدم لطلاء لوحات. وثمة عيب آخر من فحوصات رصد إقفال الجروح أو الخدوش هو دورتهم الوقت المحدود، كما يمكن فقط تحليل الهجرة الخلية حتى يتم إغلاق الصفر.
في إجراء المقايسة دوت، هي مطلي الخلايا كمستعمرة تعميم على لوحة مغلفة أو غير المصقول8. والأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية والطلاء هو الحصول على أوراق الخلية مع حواف محددة، يمكن ترحيل أو غزو في المناطق المحيطة بها خالية من الخلية دون الإخلال الثقافة بإزالة خلايا أو إدراج. والهدف العام للمقايسة دوت مراقبة الهجرة صحائف خلية مقاسا بحافة التشرد أو القطر مستعمرة، فضلا عن القيام بتصوير مرور الزمن لتحليل النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا في أعلى القرار الزمانية.
يمكن أن تتأثر الهجرة الخلية بالعديد من الإشارات ميكرونفيرونمينتال مثل المستقطبات، السيتوكينات، وعوامل النمو مثل مماثلة. لو هو عامل النمو التي تمارس إثارة البيولوجية عن طريق ربط لمستقبلات لها، لو مستقبلات9، ويزيد من السلوك الغازية والمنتشر من ورم الخلايا4،،من910. هنا، يتم استخدام المقايسة دوت لدراسة مماثلة وحفز الهجرة الخلية في مستعمرة الرئة بشرية الغازية، تشكيل الثدي سرطان الخلية خط (MCF10CA1a)8،،من1112.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء تطور الخلايا السرطانية يهاجر بعيداً عن الأنسجة الأصلية غزو الأنسجة المحيطة والسرطاني إلى مواقع بعيدة15. ويمكن ملاحظة هجرة خلايا بعيداً عن مستعمرة خلية في المقايسة دوت. ويتجلى المقايسة دوت هنا، تحليل النمط الظاهري المهاجرة من خلايا سرطان الثدي البشرية استجابة لمماثلة.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر بهاجاوات سوبرامانيان، تشانغ يي (جايسون)، بول Randazzo، والأصل كارول للقراءة والتعليق على هذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني للسرطان، “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for asay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid ) | Cayman | 10093 | used to stimulate cells |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for LPA and EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
Riferimenti
- Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O’Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
