Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse
Summary
O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.
Abstract
Meiótica progressão nos machos é um processo que exige a acção concertada de uma série de eventos celulares altamente regulamentados. Erros que ocorrem durante a meiose podem levar à infertilidade, perda de gravidez ou defeitos genéticos. Começando no início da puberdade e ao longo da vida adulta, contínuas ondas semisíncronas de espermatócitos submetido a espermatogênese e, finalmente, formam espermatozoides haploides. A primeira onda de espermatócitos de rato em fase meiótica iniciação aparecem no 10º dia pós-parto (dpp 10) e são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos como esperma madura no dpp 35. Portanto, é vantajoso utilizar ratos dentro desta janela de tempo do desenvolvimento, a fim de obter populações altamente enriquecidas de interesse. Análise dos estágios de célula rara é mais difícil em ratos mais velhos devido à contribuição das sucessivas ondas espermatogênico, que aumentam a diversidade das populações celulares dentro dos túbulos. O método descrito aqui é uma técnica facilmente implementada para a avaliação citológica das células encontradas nos túbulos seminíferos dos ratos, incluindo espermatogónias espermatócitos e espermátides. A técnica de abóbora túbulo mantém a integridade das células germinativas masculinas isoladas e permite a análise das estruturas celulares que não são facilmente visualizados com outras técnicas. Para demonstrar as possíveis aplicações desta técnica de abóbora do túbulo, montagem do eixo foi monitorada em espermatócitos progredir através da prófase para metáfase que eu transição (transição G2/MI). Além disso, duplicação centrossoma, inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) e formação de cromossomo buquê foram avaliados como exemplos das estruturas citológicas que podem ser observadas usando esse método de abóbora do túbulo. Esta técnica pode ser usada para identificar defeitos específicos durante a espermatogênese causadas por mutação ou perturbação exógena, e assim, contribui para a nossa compreensão molecular da espermatogênese.
Introduction
Meiose é um evento complexo celular em que uma única rodada de replicação do DNA é seguida por duas rondas sucessivas de divisão celular. Vários eventos de meiose específicos devem ser coordenados durante os estágios iniciais da meiose para garantir a segregação do cromossomo precisos. Estes eventos incluem a conclusão de recombinação homóloga, co a orientação da irmã cinetócoros durante a primeira divisão meiótica e a perda gradual de cohesin complexos para resolver chiasmata entre homologs. Regulamento preciso destes processos é necessário para manter a fertilidade e evitam que podem levar a disfunções no desenvolvimento genéticas e aborto espontâneo1cromossoma missegregation eventos.
Enquanto os principais eventos da meiose ocorrem em machos e fêmeas, existem diferenças significativas de temporais e mecanicistas entre espermatogênese e a ovogênese2. Por exemplo, durante a meiose feminina, prófase I ocorre durante o desenvolvimento embrionário e prende no estágio de Dictióteno até a puberdade. Em contraste, a espermatogênese começa na puberdade e progride em ondas por toda a vida adulta, sem prisão. As diferenças entre masculino e feminino meiose enfatiza a necessidade de desenvolver métodos que são servidos especificamente para avaliar estes processos em espermatócitos e oócitos. Atualmente, avaliar progressão meiótica em grande parte se baseia na utilização de cromatina se espalha3,4,5. Enquanto cromatina spreads são úteis para o estudo de cromossomos meióticos, eles falham preservar a integridade celular, impedindo a avaliação de estruturas celulares como os microtúbulos do fuso, centrossomas, o envelope nuclear e anexos dos telômeros. Ao vivo de imagens e técnicas de cultivo a longo prazo avançaram muito nossa compreensão da meiose feminina; abordagens semelhantes para visualizar toda a célula intacta, no entanto, são menos frequentemente implementadas para o estudo da espermatogênese6,7. A fim de Visualizar eventos dinâmicos durante a meiose masculina, adaptaram-se técnicas de abóbora túbulo estabelecido para avaliar rapidamente as características citológicas de desenvolver rato espermatócitos8,9. O método descrito aqui mantém a integridade da célula, permitindo o estudo de várias estruturas celulares durante diferentes estágios da espermatogênese.
Esta técnica de abóbora do túbulo é uma abordagem de célula inteira, o que permite a avaliação de estruturas celulares através de microscopia de imunofluorescência. Abordagens histológicas comuns Visualizar meiótica progressão em ratos masculinos como hematoxilina e eosina mancha de parafina incorporado testículos e rotulação de imunofluorescência de cryosections permitem uma visão ampla da progressão meiótica. No entanto, essas técnicas não conseguem resolver células únicas na medida do necessário para uma análise detalhada dos eventos ocorridos durante a meiose10,11. Técnicas alternativas para visualizar processos meióticos dependem quimiosmótica significativa perturbação para a maturação para isolar e corrigir materiais nucleares3,4,5. Estes tratamentos químicos dificultam a observação dos tipos de célula diferentes espermatócitos primários. Um método recentemente descrito por Namekawa permitiu que a comunidade de pesquisa preservar a arquitetura nuclear de espermatócitos isolados, mas requer o uso de um cytospin e acessórios que podem não estar prontamente disponíveis para alguns laboratórios4. Em contraste, a técnica de abóbora túbulo requer apenas o equipamento que é geralmente padrão na maioria dos laboratórios de biologia celular.
O método de abóbora túbulo descrito aqui pode ser usado para visualizar os tipos de célula diversos encontrados dentro do túbulo seminífero, incluindo células de sertoli, espermatogónias, espermatócitos primários e secundários, espermátides e. Por esta técnica de engate com a primeira onda perto-síncrono de espermatogênese em camundongos juvenis, é possível obter populações enriquecidas de células espermatogênico medida que progridem através de de meiose12. Este processo permite a análise detalhada dos processos em toda a espermatogênese, como primeiros eventos da prófase, metáfase, a anáfase transições e acridina e G2/MI. Além disso, preparações de abóbora túbulo podem ser usadas para visualizar características citológicas dos cromossomas (por exemplo, domínios interchromatid (ICDs) e cinetócoros) e centrossomas (centríolos e pericentriolar material/matrizes). O método de abóbora pode ser prontamente executado em paralelo com outras abordagens experimentais, tais como cromatina spreads e extração de proteínas. Além disso, esta técnica foi modificada com sucesso para depositar as células espermatogênico em lâminas para visualização directa13.
O método descrito aqui envolve uma técnica de abóbora de tubo seminífero células inteiras para analisar a transição G2/MI em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem. As características citológicas de espermatócitos primários, entrando a primeira divisão meiótica foram visualizadas com microscopia de imunofluorescência para observar o fuso meiótico. Esta técnica versátil pode ser facilmente modificada para visualizar outros estágios meióticos e diferentes tipos de células. A técnica também é passível de estratégias de visualização alternativos, tais como o DNA e RNA peixe abordagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ratos têm provado para ser um organismo modelo útil para estudar os eventos celulares que regulam a progressão meiótica durante a espermatogénese. Além disso, é necessário desenvolver ferramentas servidas para o estudo da espermatogênese porque muitos eventos, como sair da prófase meiótica, são sexualmente dimórfico. Este protocolo descreve um método de abóbora tubo seminífero para visualização e estudo de diferentes estágios da espermatogênese de rato. Este método preserva a integridade celular e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J. e uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para S.R.W. e J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
Riferimenti
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