Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.
In den letzten Jahrzehnten ist die Prävalenz von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD), gewachsen. Diese altersassoziierter Erkrankungen zeichnen sich durch das Auftreten von Protein-Aggregate mit fibrillary Struktur in den Gehirnen von Patienten. Genau warum normalerweise löslichen Proteine zu unterziehen, bleibt ein Aggregationsprozess schlecht verstanden. Die Entdeckung, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheitsprozesse und stattdessen Teil des normalen Alterungsprozesses die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Proteinaggregation, zu regulieren ermöglicht, ohne Verwendung von ectopically zum Ausdruck menschlicher Krankheit-assoziierte Proteine. Hier beschreiben wir Methoden um inhärente Proteinaggregation in Caenorhabditis Elegans durch komplementäre Ansätze zu untersuchen. Zunächst untersuchen wir wie zahlreicher Alter synchronisiert C. Elegans wachsen im Alter von Tieren zu erhalten und wir präsentieren die biochemische Verfahren um hoch-unlöslich-große Aggregate zu isolieren. In Kombination mit einer gezielten genetischen Knockdown, ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse an der Förderung oder altersabhängig Proteinaggregation zu verhindern, indem Sie entweder eine umfassende Analyse mit quantitativen Massenspektrometrie sezieren oder eine Kandidaten-basierte Analyse mit Antikörpern. Diese Erkenntnisse werden dann mit transgenen Tieren ausdrücken Leuchtstoff-Tags Aggregation neigen Proteine durch in-Vivo -Analyse bestätigt. Diese Methoden sollen erklären, warum bestimmte Proteine sind anfällig für Aggregat mit zunehmendem Alter und letztlich wie diese Proteine voll funktionsfähig zu halten.
Protein misfolding und Aggregation sind ein Markenzeichen von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie AD, PD, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und viele andere anerkannte. Α-Synuclein Baugruppen zu Amyloid-Fibrillen anzusammeln, die beispielsweise als Lewy-Körper vor allem in der Substantia Nigra von Parkinson-Patienten, während bei ALS-Patienten TDP-43 oder FUS Misfold Form zytoplasmatischen Aggregaten in degenerierenden Motoneuronen. In jedem dieser neurodegenerativen Erkrankungen nicht Mechanismen, die Aufrechterhaltung der Homöostase Protein oder Proteostase verhindern die Ansammlung von fehlgefaltete Proteine, folglich zu Krankheit führt.
Proteostase ist entscheidend für die Zellfunktionen zu gewährleisten und unter normalen Bedingungen diese Regulationsmechanismen genau steuern die Rate der Proteinsynthese, Faltung und Abbau. Mehrere Studien zeigen, dass mit der Alterung, allmählich die Fähigkeit vieler Zellen und Organe, Protein Homöostase zu bewahren gefährdet ist und die physiologische Verschlechterung der Proteostase Netze mit zunehmendem Alter ein wichtiger erschwerender Faktor für ist Neurodegenerative Erkrankungen (rezensiert in Referenzen1,2,3). Die Tatsache, dass mit zunehmendem Alter der Protein-Qualitätskontrolle und die zelluläre Reaktion auf unfolded Protein Stress beeinträchtigt werden legt nahe, dass Protein misfolding und Aggregation eine allgemeine Folge des Alterns sein könnte. In der Tat haben wir und andere gezeigt, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheit und stattdessen Teil des Proteoms hoch Waschmittel-unlöslich in Alter Tiere4,5,6,7 wird ,8,9,10. Informatik und in Vivo Analyse ergab, dass diese physiologischen altersbedingte Aggregate Krankheit Aggregate in mehreren Aspekten5ähneln. Die Entdeckung der endogenen, altersabhängigen Proteinaggregation gibt uns die Möglichkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen zu zergliedern, die Proteinaggregation, ohne Verwendung von ectopically ausgedrückt menschliche Krankheit-assoziierte Proteine regulieren. Derzeit gibt es nur begrenzte Informationen über die Regelung der weit verbreitete Protein Unlöslichkeit und über die Auswirkungen dieser Störungen auf die Gesundheit des Organismus.
Der Fadenwurm C. Elegans gehört zu den am häufigsten untersuchten Modellorganismen in der Alternsforschung, wie diese Tiere eine relativ kurze Lebensdauer haben und viele charakteristische Alterung Funktionen in höheren Organismen beobachtet zeigen. Die Auswirkungen des Alterns auf Protein Unlöslichkeit sind untersucht worden, in C. Elegans durch sequentielle biochemische Fraktionierung basierend auf unterschiedliche Löslichkeit, die weit verbreitet ist, extrahieren Sie Krankheit Aggregate im Bereich der Neurodegeneration Research11 . Durch quantitative Massenspektrometrie wurden mehrere hundert Proteine Aggregation-anfällig in C. Elegans in der Abwesenheit von Krankheit5gezeigt. Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll um große Anzahl von Würmern in Flüssigkultur und die sequentielle Extraktion aggregierte Proteine für die Quantifizierung von Massenspektrometrie und Analyse von Western-Blot isolieren zu wachsen. Denn fehlgefaltete und Aggregation neigen Proteine im Alter ansammeln C. Elegans Gonaden und Masken Veränderungen in anderen somatischen Gewebe5,12,13, verwenden wir eine Mutante Gonade-weniger Protein die Analyse darauf Unlöslichkeit in nicht-reproduktiven Geweben. Die vorgestellte Methode ermöglicht die Analyse von hoch-unlösliche, große Aggregate, die unlöslich in 0,5 % SDS und gebeizte durch relativ niedrige zentrifugale Geschwindigkeit. Alternativ wurde eine weniger strenge Extraktion-Protokoll auch kleiner und besser löslichen Aggregate sammeln10an anderer Stelle veröffentlicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Methode zur Aggregation in Vivo di C. Eleganszu beurteilen.
Alles in allem können diese Methoden in Kombination mit RNA-Interferenz (RNAi) die Rolle eines Gens von Interesse an der Modulation der altersabhängigen Proteinaggregation auswerten. Dafür beschreiben wir die Analyse von Auszügen aus jungen und alten Würmer mit und ohne Zuschlag eines spezifischen Proteins des Interesses mit RNAi. Diese Methoden sollte ein leistungsstarkes Tool zum bestimmen, welche Komponenten des Netzwerks Proteostase Protein Unlöslichkeit regulieren. Mehrere Eingriffe reduziert wie Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) 1 Signalisierung (IIS) haben gezeigt, dass C. Elegans Altern14erheblich verzögern. Langlebigkeit-Wege induzieren oft Protein-Qualitätskontrolle-Mechanismen und damit diese Wege könnten aktiv beeinflussen die Rate der Proteinaggregation. Als Beispiel zeigen wir Ihnen reduzierte inhärenten Proteinaggregation in langlebigen Tiere auf Hemmung der IIS-Pfad-7.
Hier berichten wir über eine Methodik zu isolieren, hoch-unlösliche Aggregate aus Altern C. Elegans RNAi durch Massenspektrometrie und Western blotting für Analyse unterzogen. Wir zeigen, dass Verbesserung Proteostase durch Reduzierung der IIS stark altersabhängig Proteinaggregation verhindert. Wenn Sie spezifische Aggregation neigen Proteine, in C. Elegansoverexpress auswählen, ist es möglich, weitere Mechanismen, die Modulation der inhärenten Proteinaggregation sezieren.
<p class="jove_cont…The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von DZNE und ein Marie-Curie-International Wiedereingliederungsbeihilfe (322120, D.C.D.)
Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
RNaseA | Promega | A7973 | solution |
Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
Software | |||
Image analysis software | ImageJ | ||
Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
E.coli strain | |||
OP50 | CGC | ||
RNAi bacteria | |||
L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
C. elegans mutants | |||
CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
C. elegans transgenics | |||
DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |