Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Summary

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Abstract

In den letzten Jahrzehnten ist die Prävalenz von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD), gewachsen. Diese altersassoziierter Erkrankungen zeichnen sich durch das Auftreten von Protein-Aggregate mit fibrillary Struktur in den Gehirnen von Patienten. Genau warum normalerweise löslichen Proteine zu unterziehen, bleibt ein Aggregationsprozess schlecht verstanden. Die Entdeckung, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheitsprozesse und stattdessen Teil des normalen Alterungsprozesses die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Proteinaggregation, zu regulieren ermöglicht, ohne Verwendung von ectopically zum Ausdruck menschlicher Krankheit-assoziierte Proteine. Hier beschreiben wir Methoden um inhärente Proteinaggregation in Caenorhabditis Elegans durch komplementäre Ansätze zu untersuchen. Zunächst untersuchen wir wie zahlreicher Alter synchronisiert C. Elegans wachsen im Alter von Tieren zu erhalten und wir präsentieren die biochemische Verfahren um hoch-unlöslich-große Aggregate zu isolieren. In Kombination mit einer gezielten genetischen Knockdown, ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse an der Förderung oder altersabhängig Proteinaggregation zu verhindern, indem Sie entweder eine umfassende Analyse mit quantitativen Massenspektrometrie sezieren oder eine Kandidaten-basierte Analyse mit Antikörpern. Diese Erkenntnisse werden dann mit transgenen Tieren ausdrücken Leuchtstoff-Tags Aggregation neigen Proteine durch in-Vivo -Analyse bestätigt. Diese Methoden sollen erklären, warum bestimmte Proteine sind anfällig für Aggregat mit zunehmendem Alter und letztlich wie diese Proteine voll funktionsfähig zu halten.

Introduction

Protein misfolding und Aggregation sind ein Markenzeichen von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie AD, PD, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und viele andere anerkannte. Α-Synuclein Baugruppen zu Amyloid-Fibrillen anzusammeln, die beispielsweise als Lewy-Körper vor allem in der Substantia Nigra von Parkinson-Patienten, während bei ALS-Patienten TDP-43 oder FUS Misfold Form zytoplasmatischen Aggregaten in degenerierenden Motoneuronen. In jedem dieser neurodegenerativen Erkrankungen nicht Mechanismen, die Aufrechterhaltung der Homöostase Protein oder Proteostase verhindern die Ansammlung von fehlgefaltete Proteine, folglich zu Krankheit führt.

Proteostase ist entscheidend für die Zellfunktionen zu gewährleisten und unter normalen Bedingungen diese Regulationsmechanismen genau steuern die Rate der Proteinsynthese, Faltung und Abbau. Mehrere Studien zeigen, dass mit der Alterung, allmählich die Fähigkeit vieler Zellen und Organe, Protein Homöostase zu bewahren gefährdet ist und die physiologische Verschlechterung der Proteostase Netze mit zunehmendem Alter ein wichtiger erschwerender Faktor für ist Neurodegenerative Erkrankungen (rezensiert in Referenzen^1,2,3). Die Tatsache, dass mit zunehmendem Alter der Protein-Qualitätskontrolle und die zelluläre Reaktion auf unfolded Protein Stress beeinträchtigt werden legt nahe, dass Protein misfolding und Aggregation eine allgemeine Folge des Alterns sein könnte. In der Tat haben wir und andere gezeigt, dass Proteinaggregation beschränkt sich nicht auf Krankheit und stattdessen Teil des Proteoms hoch Waschmittel-unlöslich in Alter Tiere^{4,5,6,7 wird ,8,9,10}. Informatik und in Vivo Analyse ergab, dass diese physiologischen altersbedingte Aggregate Krankheit Aggregate in mehreren Aspekten⁵ähneln. Die Entdeckung der endogenen, altersabhängigen Proteinaggregation gibt uns die Möglichkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen zu zergliedern, die Proteinaggregation, ohne Verwendung von ectopically ausgedrückt menschliche Krankheit-assoziierte Proteine regulieren. Derzeit gibt es nur begrenzte Informationen über die Regelung der weit verbreitete Protein Unlöslichkeit und über die Auswirkungen dieser Störungen auf die Gesundheit des Organismus.

Der Fadenwurm C. Elegans gehört zu den am häufigsten untersuchten Modellorganismen in der Alternsforschung, wie diese Tiere eine relativ kurze Lebensdauer haben und viele charakteristische Alterung Funktionen in höheren Organismen beobachtet zeigen. Die Auswirkungen des Alterns auf Protein Unlöslichkeit sind untersucht worden, in C. Elegans durch sequentielle biochemische Fraktionierung basierend auf unterschiedliche Löslichkeit, die weit verbreitet ist, extrahieren Sie Krankheit Aggregate im Bereich der Neurodegeneration Research¹¹ . Durch quantitative Massenspektrometrie wurden mehrere hundert Proteine Aggregation-anfällig in C. Elegans in der Abwesenheit von Krankheit⁵gezeigt. Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll um große Anzahl von Würmern in Flüssigkultur und die sequentielle Extraktion aggregierte Proteine für die Quantifizierung von Massenspektrometrie und Analyse von Western-Blot isolieren zu wachsen. Denn fehlgefaltete und Aggregation neigen Proteine im Alter ansammeln C. Elegans Gonaden und Masken Veränderungen in anderen somatischen Gewebe^5,12,13, verwenden wir eine Mutante Gonade-weniger Protein die Analyse darauf Unlöslichkeit in nicht-reproduktiven Geweben. Die vorgestellte Methode ermöglicht die Analyse von hoch-unlösliche, große Aggregate, die unlöslich in 0,5 % SDS und gebeizte durch relativ niedrige zentrifugale Geschwindigkeit. Alternativ wurde eine weniger strenge Extraktion-Protokoll auch kleiner und besser löslichen Aggregate sammeln¹⁰an anderer Stelle veröffentlicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Methode zur Aggregation in Vivo di C. Eleganszu beurteilen.

Alles in allem können diese Methoden in Kombination mit RNA-Interferenz (RNAi) die Rolle eines Gens von Interesse an der Modulation der altersabhängigen Proteinaggregation auswerten. Dafür beschreiben wir die Analyse von Auszügen aus jungen und alten Würmer mit und ohne Zuschlag eines spezifischen Proteins des Interesses mit RNAi. Diese Methoden sollte ein leistungsstarkes Tool zum bestimmen, welche Komponenten des Netzwerks Proteostase Protein Unlöslichkeit regulieren. Mehrere Eingriffe reduziert wie Insulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) 1 Signalisierung (IIS) haben gezeigt, dass C. Elegans Altern¹⁴erheblich verzögern. Langlebigkeit-Wege induzieren oft Protein-Qualitätskontrolle-Mechanismen und damit diese Wege könnten aktiv beeinflussen die Rate der Proteinaggregation. Als Beispiel zeigen wir Ihnen reduzierte inhärenten Proteinaggregation in langlebigen Tiere auf Hemmung der IIS-Pfad-⁷.

Protocol

Hinweis: Zum besseren Verständnis des Verfahrens, ist eine schematische Darstellung des Workflows (Abbildung 1) befestigt. 1. Wachstum von großen Zahlen von Jugendlichen und im Alter von C. Elegans unterzogen um RNAi gezielt ein Gen von Interesse Hinweis: Verwendung C. Elegans temperaturbedingte sterile gon-2(q388) Mutanten (CF2253), große Alter synchronisiert Populationen zu erhalten. Bei allen Arbeitsschrit…

Representative Results

Wir verwendet um wie langlebigen Tiere mit bewerten hier vorgestellten Methoden reduzierte IIS modulieren altersabhängigen Proteinaggregation. Durch Western blot (siehe Punkt 2.2, schnell unlöslichen Protein Extraktion für Western-Blot Analyse), analysiert die Summe und die unlösliche Eiweißgehalt von Young (Tag 3 des Erwachsenenalters) und im Alter von (18. Tag des Erwachsenenalters) Würmer auf Kontrolle RNAi und RNAi gezielt das Insulin / IGF-1-Like-Rezeptor Daf-2. Wir be…

Discussion

Hier berichten wir über eine Methodik zu isolieren, hoch-unlösliche Aggregate aus Altern C. Elegans RNAi durch Massenspektrometrie und Western blotting für Analyse unterzogen. Wir zeigen, dass Verbesserung Proteostase durch Reduzierung der IIS stark altersabhängig Proteinaggregation verhindert. Wenn Sie spezifische Aggregation neigen Proteine, in C. Elegansoverexpress auswählen, ist es möglich, weitere Mechanismen, die Modulation der inhärenten Proteinaggregation sezieren.

<p class="jove_cont…

Materials

Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	09830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4352135	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]