脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト
Summary
ここでマウスでジカ ウイルス小頭のモデルを確立するための手法について述べる。このプロトコルには、ジカの新生児、萌芽期、成人期の脳内接種法が含まれています。
Abstract
ジカ (ZIKV) は北、中央、南アメリカで現在流行フラビ ウイルスです。それは今、ZIKV が小頭症と他の脳の異常を引き起こす可能性が確立されます。しかし、発展途上の脳における ZIKV の発症メカニズムは不明のまま。脳内手術方法、正常と異常な脳の発達と脳の機能について質問に対処する神経科学の研究でよく使用されます。このプロトコルは、古典的な手術手技を利用し、マウス神経系におけるモデル ZIKV によるひと神経疾患を 1 つを許可する方法について説明します。直接脳接種ウイルス伝達の通常モードをモデル化しない、発展途上の脳の ZIKV 感染後結果に関しターゲットを絞った質問に調査官メソッドことができます。このプロトコルでは、ZIKV の脳室内投与の胎生期、新生児、および大人の段階について説明します。一度マスター、この方法は簡単で再現性のある手法を実行するいくつかの時間を取るだけであるになることができます。
Introduction
小頭症は、新生児の頭の平均サイズより小さいによって特徴付けられる欠陥脳開発から生じる状態です。小頭症児発育遅延、発作、知的障害、難聴、視覚障害と運動と病気の重症度に応じて、他の間でのバランスの問題を含むことができる症状の範囲を示すと1,2,3が発生します。この条件は多因子遺伝、感染エージェントと小頭症4,5,6,7,8の原因にリンクされている環境要因と自然の中 9。2015-2016 ZIKV 発生前に 10,000 出生 8 子供たちは CDC10によるとアメリカ合衆国に小頭症と診断されました。上 2 月 1日st 2016 年の世界保健機構宣言ジカ小頭症診断母親11、ZIKV 感染症に関連付けられての警急の増加に伴い、国際的懸念の公衆衛生緊急事態 12。アメリカ合衆国の ZIKV 例を CDC から最近の研究アメリカから感染個体と ZIKV 感染した母親の 4% と比較して小頭症を開発する子供のための 20 の高められた危険で母体の ZIKV 感染の結果がで起因したことを示唆しています。小頭症11児。小頭症関連付けられているブラジルの ZIKV 感染症から妊娠中に先天性欠損症の率は感染した母親が、ラテン アメリカの他の要因が高められた危険に貢献するかもしれないことを示す赤ちゃんの 17% まで影響を受けていると報告されています。13私たち知っている、ZIKV の小頭症と病態を神経前駆細胞 (NPC) 人口7,8,14がことが、脳の開発の ZIKV の完全な病態。とらえどころのないままです。さらに ZIKV 感染に伴う脳異常の基礎となる疾患のメカニズムを調査する動物モデルを開発することが重要です。
直接、ZIKV が脳の発達に与える影響を調査するには、最初 ZIKV7日 14.5 (E14.5) 脳の脳内接種を用いたマウス モデルを開発しました。この段階は、人間の妊娠14の最初の学期末の代表と見なされますとして選ばれました。この萌芽期の脳内注入法と子犬が生後第 5 (P5) 日まで生き残ることができる (〜 1 μ L 106組織培養感染量 (TCID50/mL) × 1.7)。これらの出生後の子犬は、同様に脳室の拡大、神経細胞の損失、軸索の希薄、アストログリオーシス、ミクログリア活性化12,15など感染した人間の幼児にみられる表現型の範囲を示します。新生児マウス脳が比較的成熟し、妊娠中期16, 人間の脳の発達段階に似ているとマウスの脳の発達に産後の主要なコンポーネントが含まれています。後妊娠期感染症研究では、生後感染症法が説明もされています。P1 で ZIKV に感染した新生児は、13 日間投与後に生き残ることができます。血生まれ大人の段階の感染は以前17を使用する必要がマウスに記載されているインターフェロン (IFN) 規制要因 (IRF) トランスクリプション要因 IRF-3、-5、-7 トリプル ノックアウトひずみ。このプロトコルでは、成人のマウスモデルの抗ウイルス応答を無効にすることを回避するために intraventricularly ZIKV を接種の方法について説明します。これはマウスの免疫回避中、注入のこのルートは典型的な感染経路を直接模倣しません。この矛盾に対処するため、直接、実験者は頭蓋内のルートの代わりに ZIKV の子宮内感染を実行できます。以前の仕事18から採用、この胚性感染症プロトコルでこの手法を簡潔に説明が。
ジカ ウイルスの系統がこの手法で実装 MEX1 447,19メキシコの分離、アフリカを分離氏-766 1947年20で分離があります。ジカ MEX1 44 感染したネッタイシマカから 2016 年の 1 月にメキシコのチアパス州で分離された蚊。テキサス大学医学部ガルベストン (UTMB) でアクセス権を持つこのウイルスを得た。さらに、デング ウイルス血清型 2 (DENV2) の比較研究ではこの手法を使用して接種しました。DENV2、ひずみ S16803 (GenBank GU289914 シーケンス)、1974 年にタイからの患者検体から分離され、c6/36 細胞で継代されました。ウイルスは継代 Vero 細胞で二度世界参照センター新興ウイルスのアルボ ウイルス媒介能 (WRCEVA) マウス注入前に。これはこのテクニックが同様に動作することを示して ZIKV と脳の発達に影響を与える可能性があります他の発現の多様な分譲。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳の発達における ZIKV による被害の調査のため、新生児、胎児および成体の段階で、ZIKV の脳内接種法は、ここで説明しました。簡単である反面、研究者が研究の質と関係者の安全を確保できるように、いくつかの考慮事項があります。
DENV はフラビ ウイルス属の ZIKV に密接に関連します。DENV ない因果ヒトの小児脳疾患にリンクされています。DENV2 することができます?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、成人外科と新生児のテクニックの学習に関連する彼の指導や議論のためのロチェスターの大学博士 Abdellatif Benraiss を認めたいと思います。著者はまた博士ジェームズ ・ ローダーデール脳定位固定装置のディスカッション用 UGA ではこの手法の方法論と研究大学の科学者 (円弧) 基盤の進歩の設定に関連を認めたいと思います、サポートと (NINDS 付与 F99NS105187-01 ・ R01NS097231-01 R01NS096176 02) 私たちの NIH のサポート。
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
Riferimenti
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