Oprettelse af musemodeller for Zika Virus-induceret neurologiske lidelser ved hjælp af intracerebralt injektion strategier: embryonale, Neonatal og voksne
Summary
Her beskriver vi en metode til fastlæggelse af en model af Zika virus-induceret microcephalus i musen. Denne protokol omfatter metoder til embryonale, neonatal og voksne-fase intracerebralt podning af virussen Zika.
Abstract
Zika virus (ZIKV) er en flavivirus i øjeblikket endemisk i nord-, Central- og Sydamerika. Det er nu fastslået, at ZIKV kan forårsage mikrocefali og yderligere hjernen abnormiteter. Men den mekanisme, der ligger til grund for patogenesen af ZIKV i hjernen, udvikle uklart. Intracerebralt kirurgiske metoder anvendes ofte i neuroscience research at behandle spørgsmål om både normal og unormal hjernens udvikling og hjernefunktion. Denne protokol udnytter klassiske kirurgiske teknikker og beskriver metoder, der tillader en at model ZIKV-associerede menneskelige neurologisk sygdom i nervesystemet mus. Mens direkte hjernen podning ikke model den normale tilstand af virus transmission, metoden giver mulighed for efterforskerne at stille målrettede spørgsmål vedrørende konsekvensen efter ZIKV infektion af udvikle hjernen. Denne protokol beskriver embryonale, neonatal og voksne stadier af intraventrikulært podning af ZIKV. Når styr, kan denne metode bliver en simpel og reproducerbar teknik, der kun tager et par timer til at udføre.
Introduction
Microcephalus er en tilstand som følge af defekte hjernens udvikling kendetegnet ved mindre end gennemsnitlig hoved størrelse hos nyfødte. Børn med mikrocefali udviser en række symptomer, som kan omfatte forsinket, beslaglæggelse, mentalt handicap, høretab, vision problemer og problemer med bevægelighed og balance, blandt andre, afhængigt af sværhedsgraden af sygdommen og forårsage1,2,3. Denne betingelse er multifaktoriel i naturen, med genetisk, smitsom agent, og miljømæssige faktorer knyttet til forårsager mikrocefali4,5,6,7,8, 9. Inden 2015-2016 ZIKV udbrud, blev 8 børn ud af 10.000 fødsler diagnosticeret med microcephalus i USA Ifølge CDC10. På februar 1st i 2016 Verdenssundhedsorganisationen erklæret Zika virus en Public Health Emergency International bekymring på grund af den alarmerende stigning i mikrocefali diagnoser tilknyttet ZIKV infektion i mødre11, 12. En nylig undersøgelse fra CDC ZIKV sager i USA tyder på, at mødres ZIKV infektion resultaterne i en 20-fold øget risiko for et barn at udvikle microcephalus i forhold til ikke-inficerede individer, og 4% af ZIKV smittede mødre fra USA har resulteret i børn med mikrocefali11. Satsen for mikrocefali-associerede fosterskader under graviditeten fra ZIKV infektion i Brasilien er blevet rapporteret at have påvirket op til 17% af babyer i smittede mødre, der angiver, at andre faktorer i Latinamerika kan være medvirkende til den øgede risiko 13. selv om vi ved, at ZIKV kan forårsage mikrocefali og patogenese i neurale stamceller celle (NPC) befolkning7,8,14, komplet patogenesen af ZIKV i at udvikle hjernen er fortsat undvigende. Det er vigtigt at udvikle dyremodeller for at yderligere undersøge sygdomsmekanismer underliggende hjernen abnormiteter tilknyttet ZIKV infektion.
For at direkte studere den virkning, at ZIKV har på hjernens udvikling, udviklet vi først en musemodel ved hjælp af intracerebralt podning af embryonale dag 14,5 (E14.5) hjerne med ZIKV7. Denne fase blev valgt som det betragtes som repræsentant for afslutningen af den første trimester i menneskelige drægtigheden14. Hvalpe kan overleve op til postnatal dag 5 (P5) med denne embryonale intracerebralt injektion metode (~ 1 µL af 1,7 x 106 vævskultur smitsom dosis (TCID50/mL)). Disse postnatal pups udviser en række fænotyper ligeledes observeret i inficerede menneskelige spædbørn herunder udvidet hjertekamrene, neuronal tab, cytoskeletale rarefaction, astrogliosis og microglial aktivering12,15. En nyfødt mus hjerne er forholdsvis umoden, beslægtet med udviklingsstadiet af den menneskelige hjerne på midten drægtigheden16, og musen hjernens udvikling omfatter en større postnatal komponent. For at studere senere drægtighed fase infektioner, er en metode til postnatal infektion også beskrevet. Nyfødte inficeret med ZIKV på P1 er købedygtig overleve op til 13 dage efter injektion. Blod-født voksne fase infektion er blevet beskrevet i musen tidligere17 , men kræver brugen af interferon (IFN) regulerende faktor (IRF) transskription faktorer IRF-3, -5,-7 tredobbelt knockout stamme. Denne protokol beskriver en metode til vaccination ZIKV intraventricularly for at omgå, deaktivere den antivirale svar af murine model i voksen. Mens dette omgår murine immunsystemet, efterligne denne rute injektion direkte ikke den typiske rute af infektion. For at løse denne uoverensstemmelse direkte, kan eksperimentatoren udføre en intrauterin infektion af ZIKV i stedet for intrakraniel ruten. Vedtaget fra tidligere arbejde18, har vi kort beskrevet denne teknik i protokollens embryonale infektion.
Zika virusstammer gennemføres med denne teknik omfatter den mexicanske isolat MEX1-447,19 og i Afrika isolere hr.-766 isoleret i 194720. Zika MEX1-44 blev isoleret i Chiapas, Mexico i januar 2016 fra en inficeret Aedes aegypti myg. Vi opnåede denne virus med tilladelse gennem University of Texas Medical filial i Galveston (UTMB). Derudover blev Dengue virus serotype 2 (DENV2) podet ved hjælp af denne teknik i en sammenlignende undersøgelse. DENV2, stamme S16803 (sekvens GenBank GU289914), blev isoleret fra en patient prøve fra Thailand i 1974 og passaged i C6/36 celler. Virussen var passaged to gange i Vero celler af World Reference Center for Emerging vira og Arboviruses (WRCEVA) før musen injektioner. Dette viser, at denne teknik fungerer lige godt for forskellige stammer af ZIKV og andre flavivira, der kan have en indvirkning på hjernens udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er en metode til intracerebralt podning af ZIKV i embryonale, neonatal og voksne faser for undersøgelse af ZIKV-induceret skader i hjernens udvikling. Mens ligetil, er der et par overvejelser, at efterforskere bør træffe for at sikre kvaliteten af undersøgelsen og sikkerhed for de involverede.
DENV er nært beslægtet med ZIKV i flavivirus slægten. DENV er ikke blevet aarsagsforbundet forbundet med pediatric hjernen lidelser hos mennesker. DENV2 kan med held inficere og repl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Abdellatif Benraiss på University of Rochester for hans mentorarbejde og diskussioner relevante til at lære voksne kirurgisk og nyfødte teknikker. Forfatterne også gerne anerkende Dr. James Lauderdale på UGA for brug af hans stereotaxisk udstyr og drøftelser relateret til opsætning af metode for denne teknik, og fremgang for forskning College forskere (BUER) grundlaget for deres støtte og vores NIH støtte (NINDS grants R01NS096176-02, R01NS097231-01 og F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
Riferimenti
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscienze. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
