Courants synaptiques sont enregistrables circonscrits de visualisé boutons synaptiques à la jonction neuromusculaire Drosophila troisième stade larvaire des larves. Cette technique permet la surveillance de l’activité d’un seul bouton synaptique.
Drosophila jonction neuromusculaire (NMJ) est un système excellent modèle pour étudier la transmission synaptique glutamatergique. Les auteurs décrivent la technique des enregistrements macropatch focale des courants synaptiques de boutons visualisées à la NMJ de larves de drosophile . Cette technique nécessite la fabrication sur mesure de l’enregistrement de micropipettes, ainsi qu’un microscope composé avec un fort grossissement, objectif à immersion d’eau sur de longues distances, optique (DIC) de contraste interférentiel différentiel et un fluorescent système de fixation. L’électrode d’enregistrement est positionné sur le dessus un bouton synaptique sélectionné visualisé avec DIC optique, épi-fluorescence ou les deux. L’avantage de cette technique est qu’il permet de contrôle de l’activité synaptique d’un nombre limité de sites de libération. L’électrode d’enregistrement a un diamètre de quelques microns, et les sites de sortie positionnés à l’extérieur de la jante électrode n’affectent pas sensiblement les courants enregistrés. Les courants synaptiques enregistrées ont cinétique rapide et peuvent être facilement résolus. Ces avantages sont particulièrement importants pour l’étude des lignées mutantes de voler avec l’augmentation d’activité synaptique spontanée ou asynchrone.
Drosophile est un système excellent modèle pour étudier les mécanismes moléculaires contrôlant la transmission synaptique. Le système neuromusculaire chez la drosophile est glutamatergique, et par conséquent la jonction neuromusculaire de drosophile (NMJ) peut être utilisée pour étudier les caractéristiques conservées de libération glutamatergique. Depuis Jan et de Jan étude1, le troisième stade larvaire a été largement utilisé pour étudier la transmission synaptique évoquée et spontanée en surveillant des potentiels de jonction excitateurs (PEJ) ou courants (EJC). PEJ figurent couramment dans les cellules avec une micro-électrode de verre coupants, et elles reflètent l’activité de la NMJ entière, y compris tous les boutons une synapses à la fibre musculaire donnée.
En revanche, l’activité d’un nombre limité des lieux de sortie peut être enregistrée circonscrits en positionnant un embout de micropipette près des bornes neuronales ou varicosités synaptiques. Cette technique a été initialement utilisée par Katz et Miledi2, et des enregistrements extracellulaires focales ont été employées avec succès sur diverses préparations de NMJ, dont grenouille3,4,5,6 de la souris , 7 , 8et crustacés9,10,11,12,13,14,15,16 Drosophile17,18,19,20,21,22,23. Cette approche a été développée par Dudel, qui optimisé macropatch recodage des électrodes24,25. Dans l’implémentation de Dudel, cette technique correspondait étroitement la méthode en vrac-patch-clamp26.
Le NMJ de larves de drosophile a clairement défini les boutons synaptiques, et des lignées transgéniques avec génétiquement encodés tags fluorescents neuronales (voir Table des matières) sont facilement accessibles. Ces avantages nous a permis d’enregistrer des EJCs et mEJCs un bouton synaptique sélectionné20,21,22. Nous décrivons ici cette technique en détail.
Drosophila représente un organisme modèle avantageux pour étudier la transmission synaptique. Plusieurs configurations d’enregistrement ont été utilisées à la NMJ larvaire, y compris des enregistrements intracellulaires de potentiels synaptiques, enregistrements de courants synaptiques avec deux électrodes voltage clamp33,34et focal macropatch enregistrements de courants synaptiques décrites ici. Cette dernière technique permet la quantificat…
The authors have nothing to disclose.
Pris en charge par l’octroi de NIH R01 MH 099557
Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |