Live celle Fluorescens mikroskopi for at observere væsentlige processer under mikrobielle cellevækst

Summary

Forstå funktionen af væsentlige processer i bakterier udfordrende. Fluorescens mikroskopi med target-specifikke farvestoffer kan give vigtig indsigt i mikrobiel celle vækst og celle cyklus progression. Her, bruges Agrobacterium tumefaciens som en model bakterie fremhæve metoder for levende celle imaging til karakterisering af væsentlige processer.

Abstract

Core cellulære processer såsom DNA-replikation og segregation, proteinsyntese, cellevæg biosyntese og celledeling stole på funktionen af proteiner, som er afgørende for bakteriel overlevelse. En række mål-specifikke farvestoffer kan bruges som sonder til bedre forstår disse processer. Farvning med lipofile farvestoffer giver mulighed for observation af membran struktur, visualisering af lipid microdomains og påvisning af membran blebs. Brug af fluorescerende-d-amino syre (FDAAs) at sonde lokaliteter af peptidoglycan biosyntesen kan oplyse potentielle defekter i cellevæggen Biogenese eller celle vækst mønster. Endelig kan nukleinsyre pletter indikere mulige fejl i DNA replikation eller kromosom adskillelse. Cyanine DNA pletter etiketten lever celler og er velegnet til time-lapse mikroskopi at aktivere realtids observationer af nucleoid morfologi under cellevækst. Protokoller for celle mærkning kan påføres protein nedbrydning mutanter til at identificere fejl i membran struktur, cellevæg Biogenese eller kromosom adskillelse. Time-lapse mikroskopi kan desuden bruges til at overvåge morfologiske ændringer som et vigtigt protein er fjernet og kan give yderligere indsigt i protein funktion. For eksempel, resulterer nedbrydningen af væsentlige celledeling proteiner i filamentation eller forgrening, der henviser til, at nedbrydningen af celle vækst proteiner kan forårsage celler bliver kortere eller rundere. Protokoller for cellevækst, target-specifik mærkning og time-lapse mikroskopi er her fastsat bakteriel plante-patogen Agrobacterium tumefaciens. Sammen, target-specifikke farvestoffer og time-lapse mikroskopi aktiverer karakterisering af væsentlige processer i A. tumefaciens. Endelig, de protokoller findes kan let modificeret til at probe væsentlige processer i andre bakterier.

Introduction

Progression gennem den bakterielle cellecyklus kræver koordinering af mange processer herunder membran og cellevæg biosyntesen, DNA-replikation og segregation og celledeling. Fuldt ud at forstå kompleksiteten af bakteriel cellebiologi, er det nødvendigt at studere disse væsentlige begivenheder; men dette er en ikke-trivielle opgave, da cellernes levedygtighed er kompromitteret, når centrale elementer i disse veje er mutagenized. Epifluorescensmikroskop mikroskopi kombineret med target-specifikke farvestoffer er en kraftfuld tilgang til sonde disse væsentlige processer i vildtype og mutant bakteriestammer.

Peptidoglycan-specifikke farvestoffer omfatter fluorescerende antibiotika (vancomycin-FL, bocillin-FL) og fluorescerende-d-amino syrer (for eksempel 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic syre-3-amino-d-alanin, Holm, 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). Gram-positive bakterier, har brugen af subletale koncentrationer af fluorescerende antibiotika analoger til sonde lokaliteter af peptidoglycan biosyntesen været en effektiv strategi til at afsløre peptidoglycan indsættelse mønstre^{1,2, 3,4}. Mens fluorescerende vancomycin mærkning er blevet brugt til at få indsigt i peptidoglycan indsættelse mønstre i faste Gram-negative bakterier⁵, giver den ydre membran generelt en permeabilitet barriere, der forhindrer brug af fluorescerende antibiotika som en sonde til peptidoglycan biosyntese i levende celler. I kontrast, label korte pulser af fluorescerende-d-aminosyrer eller d-aminosyrer med biorthogonal funktionelle grupper kovalent regioner i de seneste peptidoglycan indsættelse i en bred vifte af levende bakterieceller^6,7. Mønstre af peptidoglycan indsættelse, der er blevet observeret med syntetisk d-aminosyrer omfatte punktformet og septal (Escherichia coli og Bacillus subtilis), polære og septal (Agrobacterium tumefaciens og Listeria monocytogenes), septal eneste (Staphylococcus aureus) og apikale (Streptomyces venezuelae)^6,7. Disse observationer viser at bakterier udviser forskellige mønstre af cellevæggen Biogenese og at brugen af syntetiske d-amino syrer som sonder til at undersøge vækst mønster er en værdifuld strategi i mange bakterier.

Farvestoffer, at mærke bakterielle kromosomer omfatter deoxyribonukleinsyre (DNA) specifikke mindre groove bindemiddel (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) og høj affinitet cyanine farvestoffer (grøn og Orange; Se materialer liste). DAPI farvning af faste celler hjælper med tælling af bakterier fra miljøprøver⁸, hvorimod DAPI farvning af levende celler bruges til at angive bakteriel levedygtighed⁹. Derimod farvestoffer cyanine som Orange og grøn er ofte beskrevet som membran impermeant “døde” celle pletter optælles ikke-levedygtige celler⁹. Bemærkelsesværdigt, når disse reagenser, der anvendes til at probe morfologi af den bakterielle nucleoid under cellevækst, DAPI, Orange og grøn blev alle vist sig at være membran permeant og i stand til at mærkning levende celler¹⁰. Lever E. coli celler, DAPI farvning af DNA vises diffus på grund af auto-fluorescens fra cytoplasmaet og gentagne engagementer DAPI-farvede celler med ultraviolet (UV) lys perturbs nucleoid struktur¹⁰. Farvning E. coli eller B. subtilis med Orange afslører at dette farvestof er membran permeant og giver langvarig fluorescens ved binding til DNA i levende celler uden at påvirke cellevækst, DNA-replikation, eller kromosom adskillelse¹⁰ . Disse observationer tyder på at cyanine DNA farvestoffer kan bruges til at overvåge morfologi af Xanthophyta under cellevækst i mange bakterier.

Phospholipid-specific stryl farvestoffer såsom N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; Se materialer liste) er kationiske stoffer og knytte fortrinsvis med negativt ladede fosfolipider som cardiolipin og phosphatidylglycerol¹¹. Forskellige mønstre overholdes når 4-64 bruges til at mærke membranen af forskellige bakterier. I Escherichia coli, 4-64 er beriget med polakkerne i bands langs den laterale væg, og i de division websteder for sent pre-divisional celler¹². I Bacillus subtilis, 4-64 mærkning giver mulighed for visualisering af lipid spiraler¹³. I Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketter den ydre membran og er observeret i en karakteristisk “hestesko” mønster, hvor vækst pole er blottet for mærkning^14,15. Disse observationer viser, at disse bakterier udviser heterogene lipid distributioner på grund af tilstedeværelsen af lipid domæner, som bidrager til cellulære asymmetri. Ændringer i 4-64 mærkning mønstre såsom tilstedeværelsen af diffuse mærkning, blebs eller blærer, invaginations eller membran svind kan være informative i kendetegner mutanter, der påvirker distribution eller biosyntesen af lipider.

Ud over farvning celler, er bestemmelse af funktionen af proteiner deltager i væsentlige processer nødvendige. Karakterisering af væsentlige proteiner er teknisk udfordrende, fordi det ikke er muligt at slette væsentlige gener og studere de fænotypiske konsekvenser. Således er alternative tilgange, der nedbryder proteinet opstået. For eksempel kan et vigtigt gen sættes under kontrol af en inducerbar promotor snarere end dens indfødte promotor. Inducerbar initiativtagere er lydhøre over for små molekyler såsom; zink¹⁶, isopropylalkohol β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,18,19,20,21}, arabinose²², vanillate^17,23, og xylose²³, således transskription af target gen ophører og protein af interesse er forarmet når Induceren er fjernet. Alternative tilgange til nedbryder væsentlige proteiner af interesse omfatter syntetiske riboswitches²⁴ som hjælp lille molekyle-RNA interaktioner for at hindre transkription af gener, target, CRISPR indblanding^25,26 til blok transskription af target gener og inducerbar protein nedbrydning^27,28 , som bruger peptid koder for proteiner, mål for nedbrydning af ClpXP protease. Udtynding stammer giver kun en kort tid for karakterisering før cellerne mister levedygtighed, derfor mikroskopisk billeddannelse af celler med tiden under protein nedbrydningen er en kraftfuld tilgang til karakterisering. Faktisk, mikroskopi af levende bakterieceller har aktiveret forskere at få indblik i grundlæggende biologiske processer, herunder mekanismerne af celle figur vedligeholdelse, sekretion og opdelingen²⁹.

A. tumefaciens er en bakteriel plante patogen³⁰ og naturlige genetiske ingeniør^31,32. Således mekanismer relateret til patogenicitet, herunder vært-patogen interaktioner^33,34,35, sekretion³⁶og vært transformation^{30,31, 37} er blevet grundigt undersøgt. Udforme strategier, der forhindre A. tumefaciens medieret sygdom eller forbedre plante transformation ved de processer, der er afgørende for A. tumefaciens overlevelse har brug at blive bedre forstået. Brugen af mål-specifikke farvestoffer og den nylige udvikling af en protein nedbrydning strategi for A. tumefaciens¹⁸ giver mulighed for at undersøge væsentlige processer.

Her, leveres detaljerede protokoller til mikroskopisk analyse af vildtype, mutant og protein nedbrydning stammer fra A. tumefaciens . De to første protokoller beskrive hvordan du forbereder celler og mærke dem med target-specifikke farvestoffer. Den tredje protokol indeholder trinvise anvisninger for at forberede Agarosen pads (figur 1) og imaging bakterieceller (figur 2, figur 3, figur 4). Disse protokoller kan også være egnet til andre bakterier med yderligere tilpasninger for at tage højde for forskellige medier betingelser, vækstrater, ilt krav og cellestrukturer.

Protocol

1. vækst af A. tumefaciens stammer Dyrkning A. tumefaciens stammer Bruge en steril træ stick eller pipette tip til podes 1 mL af ATGN vækst medier (Se materialer liste for opskriften) med en enkelt koloni af den ønskede stamme.Bemærk: For A. tumefaciens udtynding stammer, bør ATGN indeholder 1 mM IPTG som en inducer at opretholde biosyntesen af den essentielle protein. Vokse A. tumefaciens stammer overnatning i ATGN ved 28 ° C…

Representative Results

Target-specifik mærkning af vildtype A. tumefaciens cellerFor at illustrere at celle morfologi er ikke påvirket af wash skridt eller behandling med 1% DMSO (som bruges til at fortynde de fluorescerende farvestoffer), celler blev afbildet direkte fra kulturen (figur 2A, længst til venstre panel), efter vask celler ved centrifugering som beskrevet i punkt 1.2 (figur 2A</str…

Discussion

Denne protokol indeholder en række procedurer for undersøgelse af A. tumefaciens vildtype, mutant og udtynding stammer. Det er værd at bemærke, at alle de procedurer, der er anført i afsnittet protokol kan let tilpasses til andre bakterielle stammer med yderligere ændringer for at tage højde for vækst medier, temperaturer og vækstrater.

Brugen af mål-specifikke farvestoffer er et værdifuldt redskab til at give en detaljeret karakterisering af cellecyklus begivenheder i bakt…

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.