Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Summary

Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Abstract

Los procesos celulares básicos como la replicación del ADN y segregación, la síntesis de proteínas, biosíntesis de la pared celular y división celular dependen de la función de proteínas que son esenciales para la supervivencia bacteriana. Una serie de objetivos específicos de colorantes puede utilizarse como sondas para mejor entienden estos procesos. Tinción con colorantes lipófilos permite la observación de la estructura de la membrana, visualización de microdominios lipídicos y la detección de las ampollas de la membrana. Uso de fluorescentes d-aminoácidos (FDAAs) a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda puede indicar posibles defectos en la biogénesis de la pared celular o patrones de crecimiento de la célula. Por último, las manchas de ácido nucleico pueden indicar posibles defectos en la segregación de replicación o cromosoma de ADN. ADN de Cianina manchas etiqueta viven las células y son conveniente para Time-lapse microscopía permite observaciones en tiempo real de morfología nucleoid durante el crecimiento de la célula. Protocolos para el etiquetado de células pueden aplicarse a mutantes de agotamiento de la proteína para identificar defectos en la estructura de la membrana, la biogénesis de la pared celular o la segregación cromosómica. Además, Time-lapse microscopia puede utilizarse para monitorizar los cambios morfológicos como una proteína esencial se elimina y puede proporcionar perspectivas adicionales en función de la proteína. Por ejemplo, el agotamiento de proteínas esencial división celular produce filamentación o ramificación, mientras que el agotamiento de proteínas de crecimiento celular puede causar células llegar a ser más corto o más redondos. Aquí, los protocolos para el crecimiento de la célula, específico del destino etiquetado y microscopía de Time-lapse se proporcionan para el patógeno de la planta bacteriano tumefaciens de la agrobacteria. Juntos, tintes específicos del destino y Time-lapse microscopia permiten caracterización de procesos esenciales en a. tumefaciens. Por último, los protocolos proporcionados pueden modificarse fácilmente para probar procesos esenciales en otras bacterias.

Introduction

Progresión a través del ciclo de la célula bacteriana requiere la coordinación de muchos procesos incluyendo biosíntesis de membrana y pared celular, replicación del DNA y la segregación y división celular. Para entender completamente la complejidad de la biología de la célula bacteriana, es necesario estudiar estos acontecimientos esenciales; sin embargo, se trata de una tarea no trivial ya que la viabilidad celular se ve comprometida cuando componentes clave de estos caminos son mutagenized. Microscopía de epifluorescencia juntada con colorantes específicos del destino es un enfoque poderoso para estos procesos esenciales en el tipo salvaje y mutante de cepas bacterianas.

Colorantes específicos de peptidoglicano son fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) y fluorescente-d-amino ácidos (por ejemplo, 7-hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanina; TADA). En bacterias Gram positivas, el uso de concentraciones subletales de fluorescentes antibióticos análogos a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda ha sido una estrategia efectiva para revelar peptidoglicano patrones de inserción de^{1,2, 3,4}. Mientras que el etiquetado fluorescente vancomicina se ha utilizado para ganar penetraciones en el peptidoglicano patrones de inserción en bacterias Gram-negativas fija⁵, la membrana externa proporciona generalmente una barrera de permeabilidad que impide el uso de fluorescentes antibióticos como sonda para la biosíntesis de peptidoglicano en células vivas. Por el contrario, pulsos cortos de fluorescente d-aminoácidos o d-aminoácidos con grupos funcionales de biorthogonal covalente etiqueta regiones de reciente inserción de peptidoglicano en una amplia gama de vida las células bacterianas^6,7. Patrones de inserción de peptidoglicano que se han observado con los d-aminoácidos sintéticos incluyen punteado y septal (Escherichia coli y Bacillus subtilis), polar y septal (Agrobacterium tumefaciens y Listeria monocytogenes), sólo septal (Staphylococcus aureus) y apical (Streptomyces venezuelaa)^6,7. Estas observaciones indican que las bacterias exhiben diversos patrones de la biogénesis de la pared celular y que el uso de sintéticos d aminoácidos como sondas para examinar los patrones de crecimiento es una estrategia valiosa en muchas bacterias.

Tintes que etiquetar los cromosomas bacterianos incluyen la carpeta de surco menor específicos de ácido desoxirribonucleico (ADN) (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) y colorantes de Cianina de alta afinidad (verde y naranja; vea la lista de materiales). La coloración de DAPI de células fijas ayuda a enumeración de bacterias a partir de muestras ambientales⁸, mientras que la coloración de DAPI de células vivas se utiliza para indicar la viabilidad bacteriana⁹. En cambio, colorantes de Cianina como naranja y verde son frecuentemente descritos como células “muertas” impermeant membrana manchas para enumerar las células no viables⁹. Sorprendentemente, cuando estos reactivos se utilizan para sondar la morfología del nucleoide bacteriano durante el crecimiento de la célula, DAPI, naranja y verde todos mostraron ser membrana florescente y capaz de etiquetado células vivas¹⁰. En vivo las células de e. coli , la coloración de DAPI de ADN aparece difusa debido a auto fluorescencia del citoplasma y exposiciones repetidas de células con tinción DAPI a luz ultravioleta (UV) perturba la estructura nucleoide del¹⁰. Tinción e. coli o B. subtilis con naranja revela que este tinte es membrana florescente y proporciona fluorescencia de larga duración sobre la Unión al ADN en células vivas sin afectar el crecimiento de la célula, replicación del ADN o cromosoma segregación¹⁰ . Estas observaciones sugieren que colorantes de Cianina ADN pueden utilizarse para controlar la morfología de nucleoids durante el crecimiento celular de muchas bacterias.

Phospholipid-specific stryl tintes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro de pyridinium (4-64; véase la lista de materiales) son compuestos catiónicos y asociar preferentemente con carga negativa fosfolípidos como la cardiolipina y fosfatidilglicerol¹¹. Se observan patrones distintos al 4-64 se utiliza para etiquetar la membrana de bacterias diferentes. En Escherichia coli, 4-64 se enriquece en los polos, en bandas a lo largo de la pared lateral y en los sitios de la división de pre-divisional células de¹². En Bacillus subtilis, 4-64 etiquetado permite la visualización de lípidos espirales¹³. En Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiquetas la membrana externa y se observa un patrón característico “Herradura” en el que el polo de crecimiento carece de etiquetado^14,15. Estas observaciones indican que estas bacterias exhiben distribuciones lípido heterogéneo debido a la presencia de los dominios de lípidos que contribuyen a la asimetría celular. Cambios en los patrones Etiquetadoras 4-64 como la presencia de las etiquetas difusas, las ampollas o vesículas, invaginaciones o contracción de la membrana puede ser informativa en la caracterización de mutantes que afectan a la distribución o la biosíntesis de lípidos.

Más allá de la coloración de las células, es necesario determinar la función de las proteínas que participan en los procesos esenciales. La caracterización de las proteínas esenciales es un desafío técnico porque no es posible eliminar genes esenciales y estudiar las consecuencias fenotípicas. Así, han surgido enfoques alternativos que agotan la proteína. Por ejemplo, un gen esencial se puede poner bajo el control de un promotor inducible en lugar de su promotor nativo. Promotores inducibles son sensibles a moléculas pequeñas tales como; Isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)^{17,18,19,20,21}, arabinosa²²,¹⁶, vanillate^17,23, de zinc y así la transcripción del gen objetivo deja de xilosa²³, y la proteína de interés se agota cuando se retira el inductor. Enfoques alternativos para el agotamiento de proteínas esenciales de interés incluyen riboswitches sintético²⁴ que utiliza las interacciones ARN molécula pequeña para impedir la transcripción de genes diana, CRISPR interferencia^25,26 a bloque de transcripción de genes diana y proteína inducible degradación^27,28 que utiliza etiquetas de péptidos a las proteínas de la blanco para la degradación por la proteasa de ClpXP. Cepas de agotamiento proporcionan solamente un a corto plazo para la caracterización antes de que las células pierden viabilidad, por lo tanto, la proyección de imagen microscópica de células en el tiempo durante el agotamiento de la proteína es un potente enfoque para la caracterización. De hecho, microscopía de células bacterianas vivas ha permitido a los investigadores a ganar penetraciones en los procesos biológicos fundamentales, incluyendo los mecanismos de mantenimiento de forma celular, secreción y compartimentación²⁹.

A. tumefaciens es un patógeno de planta bacteriana³⁰ e ingeniero genético natural^31,32. Así, los mecanismos relacionados con la patogenicidad, incluyendo huésped-patógeno interacciones^33,34,35, secreción³⁶y host transformación^{30,31, 37} han sido ampliamente investigados. Para diseñar estrategias que prevención la enfermedad de a. tumefaciens mediada o aumentar la planta de transformación, los procesos esenciales para la supervivencia de a. tumefaciens deban entenderse mejor. El uso de colorantes específicos del destino y el reciente desarrollo de una estrategia de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens¹⁸ proporciona un medio para investigar los procesos esenciales.

Aquí, cuentan con protocolos detallados para el análisis microscópico de cepas de tipo salvaje y mutante proteína agotamiento de a. tumefaciens . Los dos primeros protocolos describen cómo preparar las células y etiquetarlos con colorantes específicos del destino. El tercer Protocolo proporciona instrucciones paso a paso para preparar pastillas de agarosa (figura 1) y proyección de imagen las células bacterianas (figura 2, figura 3, figura 4). Estos protocolos también pueden ser adecuados para otras bacterias con adaptaciones adicionales para tener en cuenta las condiciones de los diferentes medios de comunicación, las tasas de crecimiento, requerimientos de oxígeno y estructuras celulares.

Protocol

1. crecimiento de las cepas de a. tumefaciens Cultivo de cepas de a. tumefaciens Utilice una punta de palillo o pipeta de madera estéril para inocular 1 mL de medio de crecimiento de ATGN (véase lista de materiales para la receta) con una sola Colonia de la cepa deseada.Nota: Para las cepas de a. tumefaciens agotamiento, el ATGN debe contener 1 mM IPTG como un inductor para mantener la biosíntesis de la proteína esencial. Crecen las cepas…

Representative Results

Objetivo específico de tipo salvaje Las células de a. tumefaciensPara ilustrar esa morfología de la célula no se ve afectada por los pasos de lavado o tratamiento con DMSO 1% (que se utiliza para diluir los tintes fluorescentes), las células fueron imágenes directamente de la cultura (figura 2A, panel izquierdo), después de lavar las células por centrifugación como se describe en 1.2 (<s…

Discussion

Este protocolo contiene una serie de procedimientos para la investigación de cepas de tipo salvaje, mutante y el agotamiento de a. tumefaciens . Cabe destacar que todos los procedimientos enumerados en la sección de protocolo pueden ser fácilmente adaptados para otras cepas bacterianas con modificaciones adicionales para tener en cuenta medios de cultivo, temperaturas y tasas de crecimiento.

El uso de colorantes específicos del destino es una valiosa herramienta para proporcionar …

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.