Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time
Summary
Dit manuscript beschrijft de kopie nummer variatie analyse uitgevoerd in serum of plasma DNA met behulp van real-time PCR-aanpak. Deze methode is geschikt voor de voorspelling van medicamenteuze resistentie bij castratie resistente prostaatkanker patiënten, maar het zou informatief ook voor andere ziekten.
Abstract
Serum en plasma cel gratis DNA (cfDNA) is aangetoond als een informatieve, niet-invasieve bron van biomarkers voor diagnose, prognose, toezicht en voorspelling van behandeling verzet. Vanaf de hypothese dat de androgeen receptor (AR) gene exemplaaraantal (CN) krijgen is een frequente evenement in metastatische castratie weerstand prostaatkanker (mCRPC), wij willen dit evenement in de cfDNA als een potentiële voorspellende biomarker analyseren.
We geëvalueerd AR CN in cfDNA met behulp van 2 verschillende real-time PCR-testen en 2 Referentie genen (RNaseP en geleden1). DNA bedrag van 60 ng werd gebruikt voor elke combinatie van assay. AR CN winst werd bevestigd met behulp van digitale PCR als een nauwkeuriger methode. CN variatie analyse heeft reeds aangetoond informatief voor de voorspelling van behandeling verzet in het kader van mCRPC, maar het kan zinvol zijn ook voor andere doeleinden in verschillende settings van de patiënt. GN-analyse op cfDNA heeft verschillende voordelen: het is niet-invasief, snelle en gemakkelijk uit te voeren, en het begint vanaf een klein volume van serum of plasma materiaal.
Introduction
Cel gratis DNA (cfDNA) in het bloed circuleren heeft aangetoond dat een optimale bron van biomarkers voor diagnose, prognose, toezicht en voorspelling van1,2van de weerstand van de behandeling. Vele studies hebben aangetoond een goede overeenstemming tussen DNA veranderingen (mutaties, kopie aantal variaties, epigenetische aanpassingen in de weefsels) en die gevonden in overeenkomstige plasma monsters1, bevestigt dat de circulerende tumor DNA (ctDNA) is informatief voor primaire en uitgezaaide tumor weefsel wijzigingen3. De mogelijkheid van het bestuderen van ctDNA voorziet dus in de wederopbouw van de genomische herschikkingen en kopie aantal variaties (CNVs) op specifieke oncogenen4, die de potentieel metastatische klonen en subclonal cellen aangeeft. CtDNA is aangetoond dat klinisch nuttig zijn vooral voor kanker behandeling monitoring als het specifieke mutaties en CNVs, aan specifieke gerichte therapieën5,6gerelateerde havens. Het ook overwint de behoefte aan weefsel biopsieën en laat resultaten kunnen worden verkregen op verschillende tijdstippen gedurende een bepaald kankerbehandeling in een niet-invasieve wijze.
Met betrekking tot prostaatkanker, een significante correlatie tussen het circuleren van cel-vrije androgeen receptor (AR) CNVs en behandeling response to abiraterone en enzalutamide is aangetoond, met de vermelding AR gene exemplaaraantal (CN) in cfDNA kan een veelbelovende biomarker kunnen voorspellen behandeling verzet7,8,9,10,11. CNVs van specifieke genen in ctDNA kunnen worden geëvalueerd aan de hand van verschillende benaderingen met verschillende gevoeligheid, kosten en snelheid (bv. real-time, digitale PCR, en Next Generation Sequencing).
Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle aanpak, gebaseerd op dubbelzijdig testen in real-time PCR-technologie, voor de evaluatie van de AR CN in cfDNA van serum en plasma monsters7,8. Wij vonden twee verschillende PCR-tests ontworpen op twee verschillende genomic regio’s binnen de intron 5 voor AR (Xq12) en twee andere genen, als interne standaard referentie genen bekend dat een aantal status van normale kopie in prostaatkanker (RNaseP, gelegen op 14q11; AGO1, gelegen op 1 p 34). We kozen twee referentie genen, in plaats van één, de precisie en de gevoeligheid van de resultaten te verhogen. Een hoeveelheid van DNA van 60 ng werd versterkt voor elke combinatie van assay (gecombineerde assay voor AR-assay_1 + RNaseP en voor AR-assay_2 + AGO1). Drie serum of plasma DNA-monsters van gezonde mannen werden samengevoegd en gebruikt als een kalibrator. We hebben overwogen cutoffs van > 1.5 voor AR gewin en < 0,5 voor verwijdering. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het flexibel is en dat kunnen ook andere genen worden geëvalueerd, veranderen de standaard interne referentie genen, op basis van de tumor type en kenmerken.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR GN-analyse in serum en plasma monster vormt een nieuwe, niet-invasieve benadering voor de gelaagdheid van castratie resistente prostaatkanker (CRPC) patiënten. Onlangs is gebleken dat de AR GN vermag voorspellen resultaten bij CRPC patiënten behandeld met abiraterone en enzalutamide, vóór en na chemotherapie7,8,9,10.
Het belangrijkste voordee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chiara Molinari en Filippo Martignano voor steun in data-analyse.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
