Sérum et Plasma copie numéro détection par PCR en temps réel
Summary
Ce manuscrit décrit l’analyse de variation numéro de copie exécutée dans l’ADN de sérum ou de plasma à l’aide de la méthode PCR en temps réel. Cette méthode convient pour la prédiction de la pharmacorésistance chez des patients de cancer de la prostate résistant à la castration, mais ça pourrait être instructif aussi pour d’autres maladies.
Abstract
Sérum et plasma cellulaire ADN gratuit (cfDNA) a été établi comme une source informative et non invasif de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer, pronostic, surveillance et prévision de résistance au traitement. À partir de l’hypothèse que le nombre de copies de gènes androgène récepteurs (AR) (CN) gain est un événement fréquent de cancer de la prostate métastatique castration résistance (CRPC), nous proposons d’analyser cet événement dans cfDNA comme biomarqueurs prédictifs potentiels.
Nous avons évalué AR CN en cfDNA à l’aide de 2 différents tests de PCR en temps réel et de 2 gènes de référence (RNaseP et il Y A1). Quantité d’ADN de 60 ng a été utilisée pour chaque combinaison de dosage. AR Gain CN a été confirmée par PCR numérique comme une méthode plus précise. Analyse de la variation de CN a déjà été démontré d’être informatif pour la prédiction de la résistance au traitement dans le cadre de la CRPC, mais il pourrait être utile également à d’autres fins dans des milieux différents patients. Analyse CN sur cfDNA présente plusieurs avantages : il est non invasif, rapide et facile à exécuter, et il commence à partir d’un petit volume de matière de sérum ou de plasma.
Introduction
Cellulaire gratuit ADN (cfDNA) dans le sang en circulation a été démontrée pour être une source optimale de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer, pronostic, surveillance et prévision de traitement resistance1,2. De nombreuses études ont montré une bonne concordance entre les altérations de l’ADN (mutations, exemplaire numéros variations, modifications épigénétiques dans les tissus) et ceux que l’on trouve dans le plasma échantillons correspondant1, confirmant que l’ADN de tumeur (ADNct) en circulation est instructif pour les tumeurs primaires et métastatiques tissu altérations3. La possibilité d’étudier ADNct permet ainsi à la reconstruction des réarrangements génomiques et variations de numéro (CNV) copie spécifique oncogènes4, identifier les cellules potentiellement métastatiques clonales et subclonal. ADNct s’est avéré être cliniquement utile surtout pour le suivi des traitements du cancer car il abrite des mutations spécifiques et CNV, associés à des thérapies ciblées spécifiques5,6. Il surmonte la nécessité pour les biopsies tissulaires et permet des résultats pouvant être obtenus à des moments différents au cours d’un traitement de cancer spécifique de façon non invasive.
En ce qui concerne le cancer de la prostate, une corrélation significative entre la circulation acellulaire androgène CNVs récepteur (AR) et traitement réponse à abiratérone et enzalutamide il a été établi, indiquant nombre copies gène AR (CN) en cfDNA peut être un biomarqueur prometteur capable de prévoir le traitement résistance7,8,9,10,11. CNV de gènes spécifiques dans ADNct peut être évaluée à l’aide de différentes approches avec sensibilité différente, coût et rapidité (e.g. PCR en temps réel, numérique et Next Generation Sequencing).
Nous décrivons ici une approche simple et rapide, basée sur les analyses de duplex dans la technologie PCR en temps réel, pour l’évaluation de CN AR en cfDNA du sérum et du plasma échantillons7,8. Nous avons examiné deux différentes épreuves PCR conçus sur deux différentes régions génomiques dans l’intron 5 d’ AR (Xq12) et deux autres gènes, comme des gènes de référence standard interne connus pour avoir un statut de numéro de copie normale dans le cancer de la prostate (RNaseP, Situé sur la 14q11 ; Il Y A1, situé sur 1 p 34). Nous avons sélectionné des gènes de référence deux, plutôt qu’un, pour augmenter la précision et la sensibilité des résultats. Une quantité d’ADN de 60 ng a été amplifié pour chaque combinaison de test (test combiné pour AR-assay_1 + RNaseP et AR-assay_2+ ans1). Trois échantillons d’ADN sérum ou le plasma des hommes en bonne santé ont été mis en commun et utilisés comme un étalon. Nous avons examiné les seuils de > 1,5 pour le gain de l’AR et < 0,5 pour la suppression. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle est souple et que des autres gènes peuvent aussi être évalués, changer les gènes de référence interne, sur la base du type de tumeur et caractéristiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR Analyse de la CN dans l’échantillon de sérum et le plasma représente une nouvelle approche non invasive pour la stratification des patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration (fonciers). Il a été démontré récemment que le CN AR est capable de prédire les résultats chez les malades fonciers avec abiratérone et enzalutamide, avant et après chimiothérapie7,8,9,</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Chiara Molinari et Filippo Martignano de soutien en analyse de données.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
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