Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Kopie Variation Zahlenanalyse in Serum oder Plasma DNA mit Echtzeit-PCR-Ansatz durchgeführt. Diese Methode eignet sich für die Vorhersage von Resistenzen in Kastration resistenten Prostatakrebs-Patienten, aber es könnte auch für andere Krankheiten informativ sein.
Abstract
Serum und Plasma Zelle freie DNA (Blut) wurde als informativen, nicht-invasive Quelle Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Vorhersage von Therapieresistenz gezeigt. Ausgehend von der Hypothese, dass die Androgen-Rezeptor (AR) gen Kopienzahl (CN) zu gewinnen ist ein häufiges Ereignis bei metastasiertem Kastration Widerstand Prostatakrebs (mCRPC), schlagen wir vor, dieses Ereignis im Blut als potenzielle prädiktive Biomarker zu analysieren.
Wir evaluierten AR CN im Blut mit 2 verschiedenen Echtzeit-PCR-Assays und 2 Referenz-Gene (RNaseP und AGO1). DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination verwendet. AR CN Gewinn wurde mit digitalen PCR als eine genauere Methode bestätigt. CN Variation Analyse bereits nachgewiesen, dass für die Vorhersage von Therapieresistenz in der Umgebung des mCRPC informativ sein, aber es könnte nützlich sein, auch für andere Zwecke in verschiedenen Patienten. CN-Analyse auf Blut hat mehrere Vorteile: Es ist nicht-invasiv, schnell und einfach durchzuführen, und es beginnt mit einem kleinen Volumen von Serum oder Plasma Material.
Introduction
Zirkulierenden Zelle freie DNA (Blut) im Blut nachgewiesen wurde eine optimale Quelle für Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Prognose der Behandlung Widerstand1,2. Viele Studien zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen DNA-Veränderungen (Mutationen, Kopie Nummer Variationen, epigenetische Veränderungen im Gewebe) und denen in entsprechenden Plasma Proben1, bestätigt, dass im Umlauf Tumor-DNA (CtDNA) informativ für Primär- und metastasiertem Tumor Gewebe Veränderungen3. Die Möglichkeit des Studiums CtDNA ermöglicht somit für den Wiederaufbau der genomic Rearrangements und Kopie Nummer Variationen (CNV) bei bestimmten Onkogene4Identifizierung potentiell metastasierendem klonale und subclonal Zellen. CtDNA hat sich gezeigt, zu klinisch nützlich vor allem für Krebs Behandlung überwachen, wie es bestimmte Mutationen und CNV, bezogen auf spezifische gezielte Therapien5,6birgt. Es überwindet die Notwendigkeit Gewebebiopsien und kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten während einer bestimmten Krebs-Behandlung in einer nicht-invasive Weise erzielten Ergebnisse.
In Bezug auf Prostata-Krebs, eine signifikante Korrelation zwischen zirkulierenden zellfreie Androgen Rezeptor (AR) CNV und Behandlung Antwort auf Abiraterone und Enzalutamid ist gezeigt worden, Anzeige AR gen Kopienzahl (CN) im Blut kann ein vielversprechender Biomarker zur Vorhersage Behandlung Widerstand7,8,9,10,11. CNV bestimmter Gene in CtDNA mit verschiedenen Vorgehensweisen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit, Kosten und Geschwindigkeit ausgewertet werden können (zB. in Echtzeit, digitale PCR und Next Generation Sequencing).
Hier beschreiben wir einen einfachen und schnellen Ansatz, basierend auf duplex-Assays in Echtzeit-PCR-Technologie für die Bewertung der AR CN in Blut, Serum und Plasma Proben7,8. Wir hielten zwei verschiedenen PCR-Assays entwickelt, auf zwei verschiedenen genomischen Regionen in Intron 5 AR (Xq12) und zwei andere Gene als interner standard Referenz Gene bekannt, um eine normale Nummer Kopierstatus bei Prostatakrebs (RNaseP, haben Das Hotel liegt auf 14q11; Vor1, befindet sich auf 1 s. 34). Wir haben zwei Referenz-Gene, anstatt ein, um die Präzision und Sensitivität der Ergebnisse zu erhöhen. Ein DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination (kombinierte Assay für AR-assay_1 + RNaseP und AR-assay_2 + AGO1) verstärkt. Drei Serum oder Plasma DNA-Proben von gesunden Männern wurden gebündelt und als ein Kalibrator verwendet. Wir hielten Abschaltungen von > 1,5 für AR Gewinn und < 0,5 für die Löschung. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es flexibel ist und dass auch andere Gene ausgewertet werden können, die internen Standardwerk Gene auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften ändern.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR CN-Analyse in Serum und Plasma Probe stellt eine neue, nicht-invasive Ansatz für die Stratifizierung von Patienten mit Kastration resistenten Prostatakrebs (CRPC). Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass AR CN Ergebnisse in CRPC Patienten mit Abiraterone und Enzalutamid, vor und nach der Chemotherapie7,8,9,10vorhersagen kann.
Der Hauptvorteil unse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Chiara Molinari und Filippo Martignano danken wir für die Unterstützung bei der Datenanalyse.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
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