혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여
Summary
이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.
Abstract
혈 청 및 혈장 세포 무료 DNA (cfDNA)은 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항의 예측에 대 한 생체의 유익한 정보, 비-침략 적 원본으로 표시 되었습니다. 전이성 거세 저항 전립선 암 (mCRPC)에서 자주 이벤트는 안 드로 겐 수용 체 (AR) 유전자 사본 번호 (CN) 얻을 가설에서 출발, 잠재적인 예측 biomarker로 cfDNA에서이 이벤트를 분석을 제안 한다.
우리가 2 다른 실시간 PCR 분석 실험 및 2 참조 유전자 (RNaseP 및 전1)를 사용 하 여 cfDNA에 아칸소 CN 평가. DNA 양의 60 ng 각 분석 결과 조합에 대해 사용 되었다. AR CN 이득 디지털 PCR를 사용 하 여 보다 정확한 방법으로 확인 됐다. CN 변형 분석 이미 치료 저항 mCRPC의 설정에서의 예측을 위한 유익 입증 되었습니다 하지만 그것은 도움이 될 수 있습니다 또한 다른 환자의 설정에서 다른 목적을 위해. CfDNA에 CN 분석에는 여러 이점이 있다: 그것은 비 침략 적, 신속 하 고 쉽게 수행 하 고 혈 청 또는 플라스마 소재의 작은 볼륨에서 시작.
Introduction
순환 하는 혈액에서 세포 무료 DNA (cfDNA) 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항1,2의 예측에 대 한 생체의 최적의 원본 증명 되었습니다. 많은 연구 DNA 변경 (돌연변이, 복사 번호 유사 조직에 epigenetic 수정)와 해당 플라즈마 샘플1, 순환 종양 DNA (ctDNA)는 확인 그 사이 좋은 색인 기본 및 전이성 종양 조직 변경3에 대 한 유익한. CtDNA의 가능성은 따라서 게놈 재배열 및 특정 oncogenes4, 잠재적으로 전이성 클론와 subclonal 셀 식별에 복사 번호 유사 (CNVs)의 재건에 대 한 수 있습니다. CtDNA 임상 암 치료 모니터링으로 특정 돌연변이 관련 특정 표적으로 한 치료5,6, CNVs 항구에 특히 유용한 것으로 표시 되었습니다. 그것은 또한 조직 생 검에 대 한 필요를 극복 하 고 결과 비-침략 적 방식으로 특정 암 치료 기간 동안 서로 다른 시간에 얻을 수 있습니다.
전립선 암, 순환 셀 무료 안 드로 겐 사이의 중요 한 상관 관계에 관해서는 수용 체 (아칸소) CNVs 및 치료 응답 abiraterone와 enzalutamide로 표시 되었습니다, 나타내는 AR 유전자 복사 번호 (CN) cfDNA에 있을 수 있습니다는 치료 저항7,,89,10,11예측 가능한 유망 바이오 마커. CtDNA에 특정 유전자의 CNVs 다른 감도, 비용 및 속도으로 다른 접근을 사용 하 여 평가할 수 있다 (예. 실시간, 디지털 PCR, 및 다음 세대 시퀀싱).
여기는 실시간 PCR 기술, 혈 청 및 혈장 샘플7,8cfDNA에 아칸소 CN을 평가 하기 위한 이중 분석에 따라 간단 하 고 빠른 방법에 설명 합니다. 전립선 암 (RNaseP, 일반 복사 번호 상태에 있는 것으로 알려져 내부 표준 기준 유전자로 intron 5 아칸소 (Xq12)의 다른 두 유전자 내에서 두 개의 다른 게놈 지역에 설계 된 두 개의 다른 PCR 분석 실험을 고려 14q11;에 전1, 1에 위치한 p 34). 우리는 정밀도 결과의 감도 증가 한 실행 하는 것이 아니라 두 기준 유전자 선택. 60의 DNA 양을 ng 각 분석 결과 조합 (결합 된 분석 결과 대 한 아칸소-assay_1 + RNaseP와 아칸소-assay_2+ AGO1)에 대 한 증폭 되었다. 건강 한 남성에서 3 개의 혈 청 또는 플라스마 DNA 샘플 풀링 되었고는 교정기로 사용. 우리 고려의 차단 > 아칸소 이득에 대 한 1.5와 < 삭제 0.5. 이 방법의 주요 장점 중 하나입니다 그것은 유연 하 고는 다른 유전자 또한 평가 될 수 있다, 변화 하는 표준 내부 기준 유전자 종양 유형 및 특성에 근거 하 여.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR 혈 청 및 혈장 샘플에서 CN 분석 거세 저항 전립선 암 (CRPC) 환자의 계층에 대 한 새로운, 비-침략 적 접근 방식을 나타냅니다. 그것은 최근 증명 되었습니다 아칸소 CN CRPC 환자 화학 요법7,8,,910전후 abiraterone와 enzalutamide, 치료 결과 예측 수 있다.
우리의 접근 방법의 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 데이터 분석에서 지원에 대 한 키 아 라 Molinari와 필리포 Martignano 감사합니다.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
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