Plasmaprøver kopiere nummer Detection bruke sanntid PCR
Summary
Dette manuskriptet beskriver kopi nummer variant analyse utført i serum- eller DNA ved hjelp av sanntids PCR tilnærming. Denne metoden er egnet for prediksjon av resistens i kastrering motstandsdyktig prostata cancer pasienter, men det kan være informativ også for andre sykdommer.
Abstract
Serum og plasma celle gratis DNA (cfDNA) har vist som en informativ, ikke-invasiv biomarkers for kreftdiagnose, prognosen, overvåking og prediksjon av behandling motstand. Starter fra hypotesen at androgen reseptoren (AR) genet antall kopier (CN) få en hyppig hendelse i metastatisk kastrering motstand prostatakreft (mCRPC), foreslår vi å analysere denne begivenheten i cfDNA som en potensiell prediktiv biomarkør.
Vi vurdert AR CN i cfDNA bruker 2 forskjellige sanntid PCR analyser og 2 referanse gener (RNaseP og siden1). DNA mengden 60 ng ble brukt for hver kombinasjon av analysen. AR CN gevinst ble bekreftet ved hjelp av Digital PCR som mer nøyaktig. CN variant analyse allerede er vist for å være informativ for prediksjon av behandling motstand i innstillingen for mCRPC, men det kan være nyttig også til andre formål i ulike innstillinger for pasienten. CN analyse på cfDNA har flere fordeler: det er ikke-invasiv, rask og enkel å utføre, og den starter fra en liten mengde serum- eller materiale.
Introduction
Sirkulerende cellen gratis DNA (cfDNA) i blodet har vist seg for å være en optimal biomarkers for kreftdiagnose, prognosen, overvåking og prediksjon av behandling motstand1,2. Mange studier har vist en god samsvar mellom DNA endringer (mutasjoner, kopi nummer variasjoner, epigenetic endringer i vev), og i tilsvarende plasma prøver1, bekrefter at sirkulerende svulst DNA (ctDNA) er informativ for primære og metastatisk tumor vev endringer3. Muligheten for å studere ctDNA dermed lar for gjenoppbyggingen av genomisk rearrangements og kopi nummer varianter (CNVs) på bestemte oncogenes4, identifisere potensielt metastatisk klonal og subclonal celler. CtDNA har vist seg å være klinisk nyttig spesielt for kreft behandling overvåking som havner det spesifikke mutasjoner og CNVs, knyttet til bestemte målrettet terapi5,6. Det også overvinner behov for vev biopsier og lar resultater skal oppnås på ulike tidspunkter i løpet av en bestemt kreftbehandling i en ikke-invasiv måte.
Når det gjelder prostatakreft, en signifikant sammenheng mellom sirkulerende celle-fri androgen reseptoren (AR) CNVs og behandling respons på abiraterone og enzalutamide har vist, som angir AR genet antall kopier (CN) i cfDNA kan være en lovende biomarkør kan forutsi behandling motstand7,8,9,10,11. CNVs av bestemte gener i ctDNA kan evalueres med ulike tilnærminger med forskjellig følsomhet, kostnad og hurtighet (f.eks. sanntid, digitale PCR, og neste generasjons sekvensering).
Her beskriver vi en enkel og rask tilnærming, basert på dobbeltsidig analyser i sanntid PCR-teknologi, for å vurdere AR CN i cfDNA serum og plasma prøver7,8. Vi betraktet to forskjellige PCR analyser utformet på to genomisk regioner intron 5 av AR (Xq12) og to andre gener, som interne standardreferanse gener kjent for å ha statusen normale kopi i prostatakreft (RNaseP, ligger på 14q11; Siden1, ligger på 1 p 34). Vi valgte to referanse gener, snarere enn en, å øke presisjon og følsomhet av resultatene. En DNA mengde 60 ng ble forsterket for hver analysen kombinasjon (kombinert analysen for AR-assay_1 + RNaseP og AR-assay_2 + AGO1). Tre serum- eller DNA-prøver fra friske menn var samlet og brukt som en kalibrator. Vi vurderte konsentrasjon av > 1.5 for AR gevinst og < 0,5 for sletting. En av de viktigste fordelene med denne metoden er at den er fleksibel og at andre gener kan også vurderes, endre standard intern referanse genene, på grunnlag av svulst type og egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR CN analyse i serum og plasma representerer en ny, ikke-invasiv tilnærming for lagdeling av kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) pasienter. Det har vært nylig vist at AR CN er kjøpedyktig forutsi resultatene i CRPC pasienter behandlet med abiraterone og enzalutamide, før og etter kjemoterapi7,8,9,10.
Den største fordelen med vår t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Chiara Molinari og Filippo Martignano for støtte i dataanalyse.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
