Сыворотки и плазмы скопировать номер обнаружения с помощью ПЦР в реальном времени
Summary
Эта рукопись описывает копии номер вариационный анализ выполняется в сыворотке или плазме ДНК методом ПЦР в реальном времени. Этот метод подходит для прогнозирования лекарственной устойчивости в устойчивые кастрация рак предстательной железы пациенты, но это может быть информативным и для других заболеваний.
Abstract
Сыворотки и плазмы клеток бесплатные ДНК (cfDNA) было показано, как информативный, неинвазивная источник биомаркеров для диагностики рака, прогнозирования, мониторинга и прогнозирования лечение сопротивления. Начиная от гипотезы, что андрогенных рецепторов (Ар) ген копии номер (CN) получить частые события в метастатических кастрация сопротивления предстательной железы (mCRPC), мы предлагаем для анализа этого события в cfDNA как потенциальный интеллектуального биомаркеров.
Мы оценивали AR CN в cfDNA с помощью 2 различных реального времени анализы ПЦР и 2 ссылку генов (RNaseP и Аго1). Количество ДНК в 60 ng был использован для каждой комбинации assay. AR CN прирост был подтвержден с помощью цифровой PCR как метод более точного. CN вариационный анализ уже была продемонстрирована быть информативным для прогноза лечения сопротивления в параметре mCRPC, но это может оказаться полезным также для других целей в различных пациентов. CN анализ на cfDNA имеет ряд преимуществ: это неинвазивный, быстро и легко выполнять, и она начинается с небольшой объем сыворотки или плазмы материала.
Introduction
Циркулирующих клеток бесплатные ДНК (cfDNA) в крови было продемонстрировано оптимальным источником биомаркеров для диагностики рака, прогноз, мониторинг и прогноз лечения сопротивление1,2. Многие исследования показали хороший соответствий между ДНК изменения (мутации, копии номер вариации, эпигеномные изменения в тканях) и тех, кто в соответствующий плазмы образцы1, подтверждающее, что распространение опухоли ДНК (ctDNA) информативна для первичных и метастатических опухолей ткани изменения3. Таким образом, возможность обучения ctDNA позволяет для реконструкции геномных перестроек и скопировать номер вариации (CNVs) на определенных онкогенов4, выявления потенциально метастатического клоновых и subclonal клетки. CtDNA было показано, быть клинически полезным, особенно для рака лечение мониторинг как он укрывает специфических мутаций и CNVs, связанные с конкретной целевой терапии5,6. Он также преодолевает потребность биопсия тканей и позволяет результаты должны быть получены в разное время лечения конкретных рака неинвазивным способом.
Что касается рака простаты, существенная корреляция между циркулирующих клеток свободных андрогенов рецепторов (Ар) CNVs и лечения ответ на abiraterone и enzalutamide было показано, число копии гена показывающее AR (CN) в cfDNA может быть перспективным биомаркер способны прогнозировать лечение сопротивления7,8,9,10,11. CNVs конкретных генов в ctDNA может оцениваться с использованием различных подходов с разной чувствительностью, стоимости и оперативности (например. ПЦР в реальном времени, цифровой и следующего поколения последовательности).
Здесь мы опишем простой и быстрый подход, основанный на дуплекс анализов в реальном времени технологии PCR, для оценки AR CN в cfDNA7,образцы сыворотки и плазмы8. Мы рассмотрели два различных анализы ПЦР, разработан в двух различных регионах геномной Интрон 5 AR (Xq12) и два других генов, как внутренние стандартных генов, известно, что число статус обычных копирования рака простаты (RNaseP, расположен на 14q11; Назад1, расположенный на 1 p 34). Мы выбрали два ссылку генов, а не один, чтобы увеличить точность и чувствительность результатов. ДНК, количество 60 ng был усилен для каждой комбинации пробирного (комбинированные проба для AR-assay_1 + RNaseP и AR-assay_2 + AGO1). Три образцы ДНК сыворотки или плазмы, от здоровых мужчин были объединены и используется как калибратора. Мы рассматривали предохранители от > 1.5 для AR выгоды и < 0.5 для удаления. Одним из главных преимуществ этого метода является, что он является гибким и что другие гены может также оцениваться, изменять стандартную внутреннюю ссылку генов, на основе типа опухоли и характеристики.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR CN анализа в сыворотке и плазме крови образец представляет собой новый, неинвазивная подход для стратификации пациентов рака простаты устойчивы кастрация (УПК). Недавно было продемонстрировано, что AR CN способна прогнозировать результаты в УПК пациентов с abiraterone и enzalutamide, до и…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Chiara Молинари и Мартиньяно Filippo за поддержку в области анализа данных.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
