Serum och Plasma kopia nummer detektering med realtids-PCR
Summary
Detta manuskript beskriver kopia nummer variation analysen utförs i serum eller plasma DNA med hjälp av realtids PCR-metod. Denna metod är lämplig för förutsägelse av läkemedelsresistens patienter med kastrationsresistent prostatacancer, men det kan vara informativ också för andra sjukdomar.
Abstract
Serum och plasma cell gratis DNA (cfDNA) har visat som en informativ, icke-invasiv källa av biomarkörer för diagnos, prognos, övervakning och Prediktion av behandlingsresistens. Start från hypotesen att androgen receptor (AR) gen kopia nummer (CN) få är en återkommande händelse i metastaserande kastrering motstånd prostatacancer (mCRPC), föreslår vi att analysera denna händelse i cfDNA som en potentiell Prediktiva biomarkörer.
Vi utvärderade AR CN i cfDNA med 2 olika realtids PCR-analyser och 2 referens gener (RNaseP och sedan1). DNA mängden 60 ng användes för varje kombination av assay. AR CN vinst bekräftades med Digital PCR som en mer exakt metod. CN variation analys har redan visat sig vara informativ för förutsägelse av behandling motstånd i fastställandet av mCRPC, men det kan vara användbart även för andra ändamål i olika inställningar för patienten. CN analys på cfDNA har flera fördelar: det är icke-invasiv, snabbt och enkelt att utföra, och det börjar från en liten volym av serum eller plasma material.
Introduction
Cirkulerande cell gratis DNA (cfDNA) i blod har visat sig vara en optimal källa av biomarkörer för diagnos, prognos, övervakning och Prediktion av behandling motstånd1,2. Många studier har visat en god överensstämmelse mellan DNA förändringar (mutationer, kopiera antal variationer, epigenetiska förändringar i vävnader) och de som finns i motsvarande plasma prover1, bekräftar att cirkulerande tumör DNA (ctDNA) är informativ för primär och metastaserande tumör vävnad förändringar3. Möjligheten att studera ctDNA tillåter således för återuppbyggnaden av genomisk rearrangements och kopiera antal variationer (CNVs) på specifika onkogener4, identifiera potentiellt metastaserande klonal och subclonal celler. CtDNA har visat sig vara kliniskt nyttig särskilt för cancer behandling övervakning som det hamnar specifika mutationer och CNVs, relaterad till specifika riktade terapier5,6. Det också övervinner behovet vävnadsbiopsier och ger resultat som kan uppnås vid olika tidpunkter under en specifik cancerbehandling på ett icke-invasivt sätt.
När det gäller prostatacancer, en signifikant korrelation mellan cirkulerande cellfria androgen receptor (AR) CNVs och behandling svar till abirateron och enzalutamid visats, indikerande AR gen kopia nummer (CN) i cfDNA kan vara en lovande biomarkör kan förutsäga behandling motstånd7,8,9,10,11. CNVs av specifika gener i ctDNA kan utvärderas med hjälp av olika strategier med olika känslighet, kostnad och snabbhet (t.ex. realtid, Digital PCR, och nästa generations sekvensering).
Här beskriver vi en enkel och snabb metod, baserat på duplex analyser i realtid PCR-teknik för att utvärdera AR CN i cfDNA från serum och plasma prover7,8. Vi övervägde två olika PCR-analyser utformas på två olika genomisk regioner inom intron 5 AR (Xq12) och två andra gener, som intern standard referens gener kända för att ha en normal kopia nummer status i prostatacancer (RNaseP, ligger på 14q11; Sedan1, ligger på 1 p 34). Vi valde två referens gener, i stället för att öka precision och känslighet av resultaten. En DNA mängd 60 ng förstärktes för varje analys kombination (kombinerad analys för AR-assay_1 + RNaseP och AR-assay_2 + AGO1). Tre serum eller plasma DNA-prover från friska män var poolade och används som en kalibrator. Vi ansåg cutoffs av > 1,5 för AR vinning och < 0,5 för borttagning. En av de främsta fördelarna med denna metod är att den är flexibel och att andra gener också kan utvärderas, ändra standard intern referens generna, på grundval av tumör typ och egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR CN analys i serum och plasma prov representerar en ny, icke-invasiv strategi för stratifiering av patienter med kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Det har nyligen visats att AR KN skall kunna förutsäga utfall i CRPC patienter behandlade med abirateron och enzalutamid, före och efter kemoterapi7,8,9,10.
Den största fördelen med vår…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Chiara Molinari och Filippo Martignano för stöd i dataanalys.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
Riferimenti
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
