Forbedret protokol for kromatin Immunoprecipitation fra mus skeletmuskulatur
Summary
En roman protokol for forberedelse af kromatin fra voksne mus skeletmuskulatur tilpasset til studiet af RIBOREGULATION i muskelfibre af kromatin immunoprecipitation præsenteres.
Abstract
Vi beskriver en effektiv og reproducerbare protokol for forberedelse af kromatin fra voksne mus skeletmuskulatur, en fysisk resistente væv med et højt indhold af strukturelle proteiner. Dissekeret lemmer muskler fra voksne mus er fysisk forstyrret af mekaniske homogenisering, eller en kombination af hakning og douncing, i en hypotonic buffer inden formaldehyd fiksering af cellen lysate. De faste kerner er renset af yderligere cyklusser af mekaniske homogenisering eller douncing og sekventiel filtrations fjerne celle debris. De renset kerner kan sonicated umiddelbart eller på et senere tidspunkt efter frysning. Kromatin kan være effektivt sonicated og er velegnet til kromatin immunoprecipitation eksperimenter, som illustreret ved profilerne fremstillet for transkriptionsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente Histon ændringer. De bindende begivenheder registreret bruger kromatin udarbejdet af denne protokol er overvejende dem finder sted i muskelfiber kerner trods tilstedeværelsen af kromatin fra andre fiber-forbindelse satellit og endotelceller. Denne protokol er derfor tilpasset til at studere RIBOREGULATION i voksen mus skeletmuskulatur.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) koblet til kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) og høj overførselshastighed sekventering (ChIP-FF.) er blevet metoder til valg at studere transskription og epigenetisk regulering af genekspression i forskellige væv og celletyper1. Denne teknik gør det muligt for genome-wide profilering af kovalent kromatin ændringer, Histon variant belægning og transskription faktor bindende2,3.
Mens udfører ChIP fra dyrkede celler er veletablerede, forbliver ChIP fra mammale væv mere udfordrende. Forberede ChIP kromatin indebærer flere kritiske trin, der skal optimeres for hvert vævs- og type. Kromatin kan fremstilles af de cellulære lysates af dyrkede celler eller følgende rensning af deres kerner. Mammale væv er effektiv lysis, formaldehyd fiksering og rensning af kerner kritisk for at sikre optimal nyttiggørelse af kromatin. Desuden har valget om at fastsætte kerner, før eller efter deres rensning bestemmes eksperimentelt. Trods disse forhindringer, er ChIP blevet med held udført fra væv såsom lever, testiklerne eller hjernen4,5,6. I tilfælde af skeletmuskulatur er afbrydelse af sådan en fysisk resistente væv, som udviser et højt indhold af strukturelle proteiner, og isolering af dens kerner særligt udfordrende. Givet denne specificitet, giver protokoller optimeret til andre væv ikke tilfredsstillende resultater for skeletmuskulatur.
Her beskriver vi en protokol for at isolere ChIP-grade kromatin fra mus skeletmuskulatur væv, der involverer fysisk forstyrrer vævet, formaldehyd fiksering og derefter isolation af kerner og sonikering. Effektiviteten af denne metode til at forberede kromatin egnet til ChIP fra dette væv blev demonstreret ved at udføre ChIP-qPCR og ChIP-seq for forskellige transkriptionsfaktorer, RNA polymerase II og kovalente Histon ændringer7.
Denne nye teknik er meget hurtigere end en tidligere rapporteret protokol8 bestående af lang collagenase fordøjelsen trin i hvilket tidsrum, ændringer i genomisk lokalisering af transkriptionsfaktorer og ændringer i genekspression kan finde sted. Den hurtighed, hvormed kerner er isoleret og fast gør metoden beskrevet her særligt attraktivt at forberede kromatin, der mere trofast fanger indfødte genomisk belægning stat. Desuden, selv om andre metoder for kromatin isolation eller protein udvinding fra muskelvæv har har været beskrevet8,9,10 og anvendes til ChIP-qPCR forsøg på udvalgte gener, ingen ChIP-seq data er blevet rapporteret ved hjælp af dem. Metoden rapporteret her er velegnet til transskription faktor og Histon ændring ChIP-FF., og derfor bør være også egnet til 3 / 4C eller HiC kromatin kropsbygning capture programmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en roman protokol for at forberede kromatin fra voksne mus skeletmuskulatur og vise, at denne kromatin er egnet til ChIP eksperimenter, der registrerer transskription faktor bindende og kovalente Histon ændringer i muskelfiber kerner. Denne protokol omfatter flere kritiske trin. Først er væv forstyrrelser, der kan udføres enten ved dounce eller ved mekanisk klipning. Mekanisk klipning er hurtigere og mere reproducerbare, og derfor er den foretrukne metode. Ikke desto mindre, hvis ingen passende appar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke alle ansatte i IGBMC høj overførselshastighed sekventering facilitet, medlem af “France Génomique” consortium (ANR10-INBS-09-08) og alle IGBMC generelle tjenesteydelser især personalet i IGBMC animalske facilitet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le Cancer, franske stat fonden gennem ANR under programmet Investissements d’Avenir mærket ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 og den ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. SJ blev støttet af Ligue Nationale contre le Cancer og ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 og V.U af Ministère de l’Enseignement et de la Recherche. ID er en ‘équipe labellisée’ af Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
Riferimenti
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
